促炎症消退脂质介质对干眼性别特异性及对眼表炎症消退调控的研究

发布时间：2020-01-23 05:40

【摘要】：目的干眼是临床中较为常见的炎症性和自发性免疫眼表疾病。由于干眼致病因素及发病机制较为复杂,临床中尚无针对病因的有效治疗药物。近年来促炎症消退脂质介质的抗炎和促进炎症消散的作用已得到广泛认同,并开始应用于临床中炎性疾病的治疗,但其对于干眼的治疗效果至今尚无充分的动物实验证据及相关机制探讨。因此,本实验在首先建立泪液蒸发过强合并分泌不足型干眼鼠模型的基础上,研究干眼病中眼睑及结膜组织内促炎症消退脂质介质的变化特点及其性别特异性差异,同时对消退素D1在实验性干眼愈合阶段对眼表病变的影响及调控机制进行分析和研究。方法1.干眼鼠模型的建立及其有效性评价选取实验动物6-8周龄C57BL/6雌鼠20只。随机分为4组,其中3组分别建立3、5及10天干眼鼠模型,另一组设为正常对照。温度、湿度和风速分别控制在24-28℃、30%-35%和15L/min,用以模拟干燥环境。同时小鼠皮下注射氢溴酸东莨菪碱(1mg/100μl)以减少其自身泪液分泌。对照组小鼠置于正常环境中(温度24-28℃、湿度40%-50%,无气流),无任何药物干预。角膜上皮荧光染色评分,泪液分泌量及结膜杯状细胞密度等为有效性评价指标。2.干眼对于眼睑组织中脂质介质的影响及其性别差异性的研究在第一部分研究基础上,建立鼠干眼模型。选取雌雄小鼠各15只,随机分为正常对照组、造模5天组和10天组。使用LC-MS/MS系统对样本进行脂质分析。利用髓过氧化酶(MPO)活性实验,流式细胞术,实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)及组织学观察等手段研究干眼对组织中细胞及分子水平的影响。3.消退素rvd1在实验性干眼愈合阶段对眼表病变的影响及调控作用选取实验动物6-8周龄c57bl/6雌鼠20只,随机分为正常对照组,干眼造模10天组,rvd1干预愈合组,及愈合对照组。其中两个愈合组的小鼠在经过10天造模处理后,放回正常环境中,并分别在5天愈合期内给予rvd1或安慰剂利用mpo活性实验和流式细胞术分别检测pmn和cd4+t细胞在泪腺组织中的含量。结果1.在实验动物眼,小鼠角膜上皮荧光染色评分中,造模5天组与正常对照组相比,从(0.8±0.49)分上升至(6.35±0.03)分,具有显著统计学差异(p0.05)。泪液分泌量在造模3天、5天和10天组中与对照组相比均有显著性下降。组织学切片显现上睑、穹窿结膜杯状细胞在造模组内数量减少,且胞浆较小。对照组结膜杯状细胞密度为(26.92±1.10)个/100μm,造模10天组仅为(17.73±1.65)个/100μm,差异有统计学意义(p0.01)。2.正常雌雄小鼠的眼睑及结膜组织中检测到促炎症消退脂质介质的表达。其中,dha,17-hdha及lxa4在雌鼠眼睑中的含量明显高于雄鼠(p0.0232)。与正常对照组相比,雌鼠在造模5天后,其结膜杯状细胞密度比对照组下降(35.34±0.06)%,而雄鼠造模5天时结膜杯状细胞密度比其对照组下降(51.09±0.02)%。同时,催化促炎性脂质介质合成的环氧化酶cox-2mrna在雌雄干眼模型鼠的眼睑中相对表达量比正常对照组分别增加了(17.20±3.57)倍和(14.9±2.22)倍,差异均具有统计学意义(p0.003)。在干眼影响下,花生四烯酸(aa)源性促炎症消退脂质介质(lxa4)在雄鼠眼睑中的表达量明显高于雌鼠(p=0.02),而ω-3多不饱和脂肪酸源性促炎症消退脂质介质(dha、4-hdha、17-hdha)在干眼雌鼠中的含量多于雄鼠(p0.02)。细胞学分析显示,雌鼠结膜中被cd45和ly6g抗体共同标记的pmn数量较正常对照组高3倍(n=5)。而在雄鼠中,结膜中pmn数量在对照组中为1.91%,而在造模第5天时下降到0.48%,较正常组减少了75%(n=5)。3.rvd1干预愈合组及愈合对照组小鼠的泪液分泌量在愈合期逐渐升高,并于愈合期第5天恢复至正常水平。愈合期第1天,RvD1干预组的泪液分泌量为(1.42±0.23)mm,而愈合对照组为(1.04±0.22)mm,且差异具有统计学意义(P0.02)。此外,RvD1干预组中CD4+T细胞在泪腺中的数量为4.9%,在干眼造模10天组和愈合对照组中分别为16.2%和19.5%。RvD1干预愈合组中结膜杯状细胞密度以及泪腺组织中PMN数量与愈合对照组相比均无显著统计学差异。结论1.研究中建立的小鼠模型具有干眼病的特征性眼表病理变化,对于干眼病的实验性研究具有一定价值。2.本研究首次揭示了正常眼睑及结膜组织中有促炎症消退性脂质介质的表达。干眼引起眼睑组织的炎性病变及促炎症消退脂质介质的变化与结膜中的变化特征不同,说明二者可能存在各自独立的调节机制。另外,在眼睑及结膜组织中,干眼对于促炎症消退脂质介质的影响和调节具有性别特异性。3.RvD1对于干眼病组织中的炎性免疫细胞有潜在的调节作用,并可促进干眼愈合早期的泪液分泌。
【图文】：

过程,花生酸,多不饱和脂肪酸,抗炎

图 1 部分由 AA、EPA 和 DHA 合成的脂质介质的合成过程及其作用（引自 Serhan andPetasis 2011）2.1 ω-6 多不饱和脂肪酸源性抗炎促消退脂质介质 LXA4在眼组织炎症中的调控作用ω-6 多不饱和脂肪酸 AA 在不同的特定细胞内被三大酶家族代谢，并产生LXs 等类花生酸（eicosanoids）。这三大酶家族包括环氧化酶（cyclooxygenases,COXs），脂肪氧化酶（lipoxygenases, LOXs）和细胞色素 P450（cytochrome P450s,CYP450s），在眼组织中均有功能性表达。其 G 蛋白偶联受体供 LXs 等类花生酸结合，进而发挥生物学作用。除 ω-6 AA 外，DHA、EPA 等 ω-3PUFA 同样受到这些酶的催化。LXs 是第一个被发现具有抗炎、促炎症消退作用的内源性脂质介质[26]。它主要形成于急性炎症的消退阶段，在中性粒细胞（polymorphonuclear，，PMN）与血小板、内皮细胞或上皮细胞相互作用时，由 AA 在 LOX 酶的生物催化下产[27,28]

液质联用,伯克利分校,美国加州,大学

图 2 LC/MS/MS 系统液质联用仪（源自 Gronert 实验室美国加州大学伯克利分校）本课题包括以下三部分：第一部分：干眼鼠模型的建立及其有效性评价第二部分：干眼对于眼睑组织中脂质介质的影响及其性别差异性的研究第三部分：消退素 RvD1在实验性干眼愈合阶段对眼表病变的影响及调控作用
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R777.34

【共引文献】