人牙髓干细胞分化为角膜上皮样细胞的可行性研究

发布时间：2020-03-23 09:59

【摘要】：目的体外模拟角膜上皮细胞生长微环境诱导人牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs),观察其分化为角膜上皮样细胞的能力,并初步研究DPSCs与猪来源脱细胞小肠黏膜下层(Small intestine submucosa,SIS)支架材料的生物相容性,探讨DPSCs作为种子细胞用于组织工程角膜上皮构建的可行性。方法改良组织块酶消化法分离培养DPSCs,流式细胞术进行鉴定。将条件培养基(Conditioned medium,CM)与基础培养基(Basic medium,BM)混合,配制成比例为10%、20%、30%、40%、60%、90%、100%CM的培养基,分别用于培养DPSCs。CCK-8法检测细胞增殖活性,选用30%、60%、90%CM体外诱导DPSCs,BM培养的DPSCs设为对照组,免疫荧光法检测角膜上皮细胞标记物细胞角蛋白3(Cytokeratin3,CK3)、细胞角蛋白 12(Cytokeratin12,CK12)的表达。制备无菌脱细胞SIS及其浸提液,采用脱细胞SIS浸提液培养DPSCs,并将无菌脱细胞SIS与DPSCs共培养,CCK-8法检测DPSCs的增殖活性,同时将DPSCs接种到脱细胞SIS表面,HE染色观察DPSCs的生长情况。结果培养4天时,梭形细胞从牙髓组织周围爬出;继续培养至第7天,细胞呈集落生长;培养至第9天,细胞呈放射状生长;14天时,细胞呈现密集的螺旋状生长;1:3正常传代,继续培养,第2天时细胞密度达80%,呈典型的长梭形,传代7次后,细胞形态稳定,胞质饱满均匀,增殖能力强。牙髓细胞高表达间充质干细胞表面标记物CD90(99.26%)、CD105(98.69%),几乎不表达造血干细胞表面标记物CD34(1.19%)、CD45(0.99%)。诱导3天时,30%、60%、90%CM组细胞不表达CK3,60%和90%CM组细胞开始表达CK12;7天时,30%、60%、90%CM组细胞可见CK3、CK12的表达;11天和14天时,30%、60%、90%CM组细胞继续表达CK3、CK12。诱导3、7、11、14天时,BM组细胞未见CK3、CK12表达。脱细胞SIS浸提液和脱细胞SIS对DPSCs增殖活性的影响,与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。DPSCs接种到脱细胞SIS表面后,HE染色可见细胞能够在脱细胞SIS表面生长。结论1.DPSCs在条件培养基诱导下能够分化为角膜上皮样细胞;2.DPSCs与脱细胞SIS具有良好的生物相容性;3.DPSCs作为种子细胞用于组织工程角膜上皮的构建具有可行性。
【图文】：

原代培养,传代培养,细胞

图２邋ＤＰＳＣｓ原代培养和传代培养逡逑Ａ．４天后细胞从组织周围爬出（１０0ｘ）邋；邋Ｂ．４天后贴壁的单细胞（１０0ｘ）邋；邋Ｃ．７天逡逑后的细胞状态（ｌ00ｘ）；邋Ｄ．９天后的细胞状态（１０0ｘ）；邋Ｅ．１４天后的细胞状态（１０0ｘ）；逡逑Ｆ．传代后的细胞状态（１０0ｘ）逡逑２６逡逑

过程图,过程,第三磨牙,牙髓组织

图１取材过程逡逑Ａ．完整拔除第三磨牙；Ｂ．浸泡于ＰＢＳ中的第三磨牙；Ｃ．取出的牙髓组织；Ｄ．消化逡逑后的牙髓组织逡逑：Ｅ邋’邋：，詹ｙ邋．”．冗二；逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R77

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