PAX6对mESCs增殖与分化影响及相关信号分子探讨

发布时间：2020-03-31 15:20

【摘要】：目的:探讨PAX6对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的生物学特性的影响及其潜在作用机制。方法:分别用过表达PAX6慢病毒重组质粒载体p-CDH-CMV-MCS-EF1-CopGFR-T2A-Puro和干扰载体pSICOR-shPAX6对mESCs进行感染,对感染后的细胞进行PAX6、GFP免疫荧光染色鉴定;感染效率采用Western blot进行验证;采用CCK8法检测PAX6对mESCs增殖能力的影响;流式细胞仪检测PAX6对mESCs周期的影响;于条件培养的第7天在显微镜下观察各组mESCs的形态变化;Western blot检测角膜缘干细胞分化标志蛋白K5、K14,PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-P70S6K、P70S6K、GLUT1的表达;葡萄糖生化试剂盒和ATP检测试剂盒分别被用来检测mESCs葡萄糖和ATP含量的变化。结果:慢病毒重组质粒载体感染mESCs后,免疫荧光染色鉴定结果显示PAX6过表达组mESCs可见PAX6表达,对照组、过表达空载体组与PAX6干扰组未见PAX6表达。Western blot结果显示PAX6过表达组可见PAX6蛋白表达,对照组,过表达空载体组与PAX6干扰组未见PAX6蛋白表达。与对照组相比,相同时间节点下,PAX6过表达组能够抑制mESCs的增殖,而PAX6干扰组能够促进mESCs的增殖,随着时间的延长,PAX6干扰组促进mESCs增殖的效果更加明显。PAX6过表达组的mESCs细胞周期G1期出现阻滞。光镜下观察各组mESCs在第7天的细胞形态变化,结果显示,四组细胞均呈圆形或椭圆形,边界清晰,与对照组相比,PAX6干扰组细胞较为松散,而PAX6过表达组mESCs则排列紧密,呈集落状生长,呈现出向角膜缘干细胞样细胞过渡的形态。与对照组相比,PAX6过表达组蛋白K5、K14表达量明显升高。与对照组相比,PAX6过表达组、PAX6过表达+BKM120组和BKM120组的p-PI3K,p-AKT,p-P70S6K,GLUT1蛋白表达量显著降低(P0.05),mESCs内ATP和葡萄糖含量出现不同程度的减少(P0.05)。结论:PAX6通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性,减少mESCs的ATP及葡萄糖含量,从而抑制mESCs的增殖;PAX6可诱导mESCs向LSCs分化,并促进角膜分化标志蛋白K5、K14的表达。
【图文】：

图 1. mESCs 细胞培养光镜图（100×）Figure .1 ESCs cell culture.A. MESCs cells cultured in MEF feeding layer; B. MESCs cellscultured without MEF feeder layer; C. mESCs cell alkaline phosphataseAPstaining.2.1.2 SSEA1、OCT4 免疫荧光染色单克隆抗体 SSEA1 mouse mAb 加 anti-mouse IgG-CY3，OCT4 rabbit mAb 加anti-rabbit IgG-CY3 染色，，可见 mESCs 胞质内 OCT4 阳性表达（红色荧光），细胞胞膜 SSEA1 阳性表达（红色荧光），结果显示 mESCs 仍处于未分化状态，具有多能性，具备胚胎干细胞的特征。（图 2）T4100um A-1 100um B-1100um C-1100um D-1

图 1. mESCs 细胞培养光镜图（100×）Figure .1 ESCs cell culture.A. MESCs cells cultured in MEF feeding layer; B. MESCs cellscultured without MEF feeder layer; C. mESCs cell alkaline phosphataseAPstaining.2.1.2 SSEA1、OCT4 免疫荧光染色单克隆抗体 SSEA1 mouse mAb 加 anti-mouse IgG-CY3，OCT4 rabbit mAb 加anti-rabbit IgG-CY3 染色，可见 mESCs 胞质内 OCT4 阳性表达（红色荧光），细胞胞膜 SSEA1 阳性表达（红色荧光），结果显示 mESCs 仍处于未分化状态，具有多能性，具备胚胎干细胞的特征。（图 2）100um
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R77

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本文编号：2609245