TL1A在非增生期糖尿病性视网膜病变中对血-视网膜屏障的保护作用及机制探究

发布时间：2020-04-19 22:25

【摘要】：目的:本研究旨在揭示TL1A在非增生期糖尿病性视网膜病变中的变化趋势及转录调控机制,探究TL1A在疾病状态下对血-视网膜屏障所发挥的保护作用及机理。方法:体外实验:(1)通过高糖刺激人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)以及大鼠条件性永生化视网膜血管内皮细胞(i RRMEC),建立高糖诱导的视网膜血管内皮渗漏的体外模型;并通过Western Blot及RT-q PCR的方式检测TL1A在经高糖处理后的表达变化。(2)通过motif分析的方式,预测可能调节TL1A的转录因子;利用WB以及免疫荧光染色(IF)检测相关转录因子在高糖状态下的变化情况,并通过Ch IP-q PCR、Luciferase assay以及si RNA等实验验证相关转录因子对TL1A的调控功能。(3)利用TL1A重组蛋白处理内皮细胞,研究TL1A在高糖环境下对血管内皮细胞钙黏蛋白VE-Cadherin的保护作用;同时利用探针跳跃式离子电导显微镜(HPICM)以及生物素-亲和素系统验证TL1A对高糖导致的血管内皮细胞完整性破坏的保护作用。(4)利用免疫共沉淀(Co-IP)探究TL1A对高糖导致的视网膜血管内皮细胞完整性破坏的保护机制。体内实验:(1)通过给予雄性Wistar大鼠腹腔注射STZ的方式,建立糖尿病性视网膜血管渗漏的体内模型。(2)利用改良版Miles实验验证TL1A重组蛋白对糖尿病性血管渗漏的保护作用,同时寻找大鼠玻璃体腔注射TL1A重组蛋白的最佳剂量及干预时间。(3)利用IF方法观察大鼠玻璃体腔注射TL1A重组蛋白对糖尿病性视网膜血管渗漏的保护作用。结果:体外实验:(1)高糖刺激2小时可以引起视网膜内皮细胞VE-Cadherin p-Tyr685位点激活,导致血管渗漏。与此同时,视网膜内皮细胞中TL1A的表达量显著下调(P0.05)。(2)高糖刺激下FOXP1表达升高,并负向调控TL1A的表达(P0.05)。(3)体外给予TL1A重组蛋白250ng/ml或者内源性过表达TL1A可以显著抑制高糖诱导的VE-cadherin磷酸化,改善高糖引起的血管渗漏(P0.05)。(4)TL1A与其受体DR3结合可以抑制Src p-Tyr416的磷酸化,进而抑制VE-Cadherin p-Tyr685的磷酸化,从而保护内皮细胞间粘附连接。体内实验:(1)糖尿病2周模型可以检测到TL1A表达量下降,但随疾病模型时间延长TL1A表达量有所回升。(2)糖尿病2周模型玻璃体腔注射0.1ng TL1A重组蛋白可以避免蛋白本身所引起的视网膜出血及渗出。(3)糖尿病2周模型玻璃体腔注射TL1A重组蛋白可以改善糖尿病性视网膜血管渗漏。结论:(1)高糖诱导的人和大鼠视网膜微血管内皮细胞以及DR模型导致的TL1A表达下降,可能参与糖尿病性视网膜病变中病理性血管渗漏的发生。(2)早期进行低剂量TL1A干预可以延缓糖尿病性视网膜血管渗漏的发展。此研究可能为糖尿病性视网膜病变的治疗提供新靶点。
【图文】：

21图1.1 人视网膜微血管内皮细胞血管渗漏模型的建立。图1.1A示人视网膜微血管内皮细胞模型建立相关分子指标蛋白水平检测。图1.1B示各分子指标蛋白相对表达量（n=3，* P<0.05 vs. Normal）。图1.1C示免疫荧光染色观察正常组及高糖刺激24小时组细胞间VE-Cadherin蛋白形态及分布情况（×400），箭头所示为明显的锯齿状改变及细胞间隙断裂。图1.1D示正常组及高糖刺激24小时组细胞间粘附连接蛋白分布统计情况。图1.1E示正常及高糖刺激24小时组细胞间缝隙指数分析统计情况。（n=3，* P<0.05）。1.2.1.2 大鼠条件性永生化视网膜血管内皮细胞血管渗漏模型的建立用Western Blot方法检测不同糖浓度状态下渗透压对内皮细胞VE-Cadherin蛋白活化的影响。如图1.2所示，甘露醇40mmol/L刺激8小时不会引起VE-Cadherin赖氨酸685位点的活化，但在甘露醇50mmol/L刺激状态下，蛋白表达量明显增加。图1.2 高糖状态下渗透压对大鼠条件性永生化视网膜血管内皮细胞模型的影响。甘露醇40mmol/L时，VE-Cadherin赖氨酸685位点低表达

1.2.1.2 大鼠条件性永生化视网膜血管内皮细胞血管渗漏模型的建立用Western Blot方法检测不同糖浓度状态下渗透压对内皮细胞VE-Cadherin蛋白活化的影响。如图1.2所示，甘露醇40mmol/L刺激8小时不会引起VE-Cadherin赖氨酸685位点的活化，但在甘露醇50mmol/L刺激状态下，蛋白表达量明显增加。图1.2 高糖状态下渗透压对大鼠条件性永生化视网膜血管内皮细胞模型的影响。甘露醇40mmol/L时，VE-Cadherin赖氨酸685位点低表达，甘露醇50mmol/L时，VE-Cadherin赖氨酸685位点高表达。用Western Blot 方法检测高糖刺激后各时间点血管渗漏相关指标的变化。条件性永生化大?
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1

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本文编号：2633804