CGRP在小鼠真菌性角膜炎中的表达和作用

发布时间：2020-04-20 04:14

【摘要】：目的:研究在C57BL/6小鼠烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,AF)感染的真菌性角膜炎中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达变化,并探讨CGRP在真菌性角膜炎发病过程中的相关作用。方法:1.将6-8周SPF级的雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组与真菌角膜炎组,采用把2μL烟曲霉菌分生孢子(2.5×10~4CFU/μL)向C57BL/6小鼠角膜基质内注射的方式,建立1天、3天和5天的真菌性角膜炎小鼠动物模型。在裂隙灯下拍摄1、3和5天小鼠角膜烟曲霉菌感染情况并分别记录每个小鼠角膜的临床评分。分别采用real-time PCR、Western Bolt检测小鼠对照组角膜与烟曲霉菌性角膜炎中CGRP mRNA和蛋白的表达变化情况,并采用组织免疫荧光测定CGRP在小鼠角膜的蛋白定位。2.采用3%硫代乙醇培养基提取C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,并使用灭活的烟曲霉菌菌丝分别刺激4、8、12小时后,采取real-time PCR和Western Bolt检测巨噬细胞中CGRP的mRMA及蛋白表达变化。用烟曲霉菌菌丝刺激小鼠巨噬细胞8小时后,用细胞免疫荧光法检测巨噬细胞CGRP的定位情况。3.给予外源性CGRP或CGRP的拮抗剂CGRP_(8-37)对小鼠腹腔提取的巨噬细胞进行预处理30 min,再用烟曲霉菌灭活菌丝刺激巨噬细胞12小时之后,采用real-time PCR法检测不同炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、MIP-2、TGF-β和IL-10的基因表达水平变化。外源性CGRP或CGRP_(8-37)预处理巨噬细胞30分钟后,使用烟曲霉菌灭活菌丝刺激小鼠巨噬细胞24小时,用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养液中促炎因子IL-1β及TNF-α蛋白水平的表达变化。结果:1.与小鼠对照组角膜相比较,烟曲霉菌分生孢子感染小鼠角膜第1天与第3天后神经肽CGRP mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义;而第5天时真菌组小鼠角膜中CGRP mRNA表达水平无明显改变。第1、3和5天时真菌组小鼠角膜的CGRP蛋白表达水平较对照组角膜组相比均有提升,差异有统计学意义。并且烟曲霉菌分生孢子感染角膜组的临床评分均明显提高,差异有统计学意义。2.与对照组巨噬细胞组相比较,用灭活的烟曲霉菌菌丝刺激小鼠腹腔巨噬细胞4、8和12小时后CGRP的mRNA表达水平及CGRP蛋白表达水平都有明显升高,并且在烟曲霉菌菌丝刺激8小时后CGRP mRNA及蛋白的表达水平可以达高峰,差异有统计学意义。细胞免疫荧光显示CGRP蛋白主要在巨噬细胞的细胞核中表达,烟曲霉菌刺激后CGRP的表达水平升高。3.给予外源性CGRP对巨噬细胞进行预处理之后再建立烟曲霉菌刺激的巨噬细胞模型,与单纯的烟曲霉菌菌丝刺激组相比较,CGRP+烟曲霉菌组的促炎因子IL-1β及TNF-α在mRNA表达水平和蛋白表达水平上明显降低,IL-6的mRNA表达水平亦有所下降,抑炎因子IL-10的mRNA表达提高;而MIP-2及TGF-β的mRNA变化水平无明显变化,差异无统计学意义。拮抗剂CGRP_(8-37)预处理后,促炎因子IL-1β及TNF-αmRNA表达水平和蛋白表达水平均有提高,并且IL-6的mRNA表达也明显提高,然而IL-10、MIP-2及TGF-βmRNA水平表达无明显改变,差异无统计学意义。结论:C57BL/6小鼠角膜感染烟曲霉菌后,CGRP的蛋白表达水平与mRNA表达水平均有提高,提示内源性神经肽CGRP可以参与真菌性角膜炎的炎症反应。外源性CGRP预处理烟曲霉菌感染的巨噬细胞可以降低促炎因子的表达水平,增加抑炎因子的表达;使用CGRP_(8-37)预处理后可以增加促炎因子的表达,提示CGRP在烟曲霉菌性角膜炎中可以起到抗炎作用。
【图文】：

形态图,烟曲霉菌,分生孢子,菌丝

（A-B）烟曲霉菌菌丝及分生孢子形态

烟曲霉,腹腔巨噬细胞,烟曲霉菌,小鼠

附录图 2.（A-E）小鼠烟曲霉菌性角膜炎中 CGRP 的表达情况。（A）和（B）为小鼠角膜感染烟曲霉菌后 1d、3d、5d 在裂隙灯显微镜下拍照及临床评分；（C）和（D）为CGRPmRNA 和蛋白在感染烟曲霉菌后的表达情况；（E）是对 CGRP 进行免疫荧光染色绿色的代表 CGRP，蓝色的代表 DAPI。aP<0.05,bP<0.001。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R772.21

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