VPS33B与NESG1相互作用抑制鼻咽癌增殖及诱导5-氟尿嘧啶化疗敏感

发布时间：2020-05-23 03:43

【摘要】：鼻咽癌是来源于鼻咽粘膜上皮的一种高度恶性上皮性肿瘤,是东南亚地区尤其是中国两广地区的高发性肿瘤。目前研究表明,鼻咽癌的发病可能与基因易感性、EB病毒感染、特定饮食习惯等因素有关。鼻咽癌对放射治疗敏感度较高,因此放疗是早期鼻咽癌的主要治疗手段。然而鼻咽癌极易出现放疗抵抗,化疗因此成为必不可少的辅助治疗手段。癌基因与抑癌基因的失衡是肿瘤发生及进展的重要基础。VPS33B全称为vacuolar protein sorting 33 homolog B(yeast),其编码蛋白主要参与蛋白排序与液泡转运。目前关于VPS33B基因的报道大部分集中于关节挛缩、肾功能不全和胆汁淤积综合征(ARC syndrome)和巨核细胞与血小板α-颗粒的生物合成障碍等疾病上。NESG1官方名称为CCDC19,该基因特异性的表达于鼻咽和气管纤毛柱状上皮。已有多项研究证实该基因在鼻咽癌及肺腺癌等肿瘤中发挥抑癌基因作用。但其对鼻咽癌抑癌作用的深入机制尚未阐明。在本次研究中,我们研究了 VPS33B与NESG1 相互作用调控EGFR/PI3K/AKT/c-Myc/p53/miR-133a-3p环路从而抑制鼻咽癌增殖及促进其对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的机制,为鼻咽癌发生发展的分子机制研究提供新思路,并为鼻咽癌治疗带来了新的靶标。研究内容与方法1.VPS33B通过EGFR/PI3K/AKT促进鼻咽癌对5-氟尿嘧啶化疗敏感性。利用Western Blot实验进一步验证VPS33B对PI3K/AKT信号通路相关因子调控机制并利用细胞毒性实验及裸鼠生存模型验证VPS33B促进鼻咽癌对5-Fu化疗敏感性。2.miR-133a-3p抑制鼻咽癌细胞增殖及其分子机制。(1)功能实验检测miR-133a-3p对鼻咽癌增殖的影响;(2)机制实验检测miR-133a-3p所调控的信号通路及其靶基因。3.c-Myc/p53通过调控EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制miR-133a-3p对鼻咽癌增殖的抑癌作用;(1)生物信息学预测miR-133a-3p及p53启动子结合的转录因子;(2)ChIP、EMSA及双荧光素酶报告实验检测其预测转录因子是否结合并调控转录;(3)检测c-Myc/p53是否调控miR-133a-3p;4.VPS33B诱导miR-133a-3p调节EGFR/PI3K/AKT/c-Myc/p53形成负性调控环路(1)检测VPS33B是否调控miR-133a-3p表达利用qPCR实验检测过表达VPS33B对鼻咽癌细胞中miR-133a-3p表达量的改变;(2)功能及机制实验验证EGFR或EGF介导VPS33B的功能及其相关信号通路;5.VPS33B与NESG1相互作用和诱导(1)验证VPS33B与NESG1是否相互作用;(2)功能及机制实验验证VPS33B与NESG1相互的调控关系;6.LMP-1及尼古丁通过PI3K/AKT/c-Jun信号通路抑制VPS33B表达(1)检测LMP-1及尼古丁是否调控VPS33B表达;(2)机制实验分析LMP-1及尼古丁如何调控VPS33B表达;7.VPS33B在鼻咽癌组织中的表达及其临床相关性分析(1)利用免疫组化检测VPS33B及NESG1在鼻咽及鼻咽癌组织中的表达情况;(2)VPS33B与NESG1的相关性分析及VPS33B的临床相关性分析。结果及结论1.VPS33B通过EGFR/PI3K/AKT信号通路促进鼻咽癌对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。2.miR-133a-3p通过靶向EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖;3.VPS33B调控的EGFR/PI3K/AKT/c-Myc/p53/miR-133a-3p负反馈环路抑制鼻咽癌增殖;4.VPS33B通过EGFR/PI3K/AKT/c-Jun信号通路与NESG1相互作用并调控上述信号环路;5.LMP-1及尼古丁通过PI3K/AKT/c-Jun信号通路抑制VPS33B表达;6.VPS33B在鼻咽癌中低表达,但其高表达是鼻咽癌临床预后良好的指标。
【图文】：

逦第一章ＶＰＳ３３Ｂ促进鼻咽癌对５－氟尿嘧啶化疗敏感逦逡逑为４ｐｇ／ｇ，给药方式为腹腔注射。给药时间间隔为４天。对照组使用生理盐水腹逡逑腔注射。计算裸鼠生存时间及称量其体重。逡逑二结果逡逑１．荧光定量ＰＣＲ及ＷＢ检测稳定过表达鼻咽癌细胞株ＨＯＮＥ１－ＶＰＳ３３Ｂ和逡逑ＳＵＮＥ１－ＶＰＳ３３Ｂ中ＶＰＳ３３Ｂ的表达情况逡逑选取生长状态良好的ＨＯＮＥ１－ＶＰＳ３３Ｂ和ＳＵＮＥ１－ＶＰＳ３３Ｂ细胞提取ＲＮＡ逡逑并逆转录，以进行荧光定量ＰＣＲ以及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测所选细胞株内ＶＰＳ３３Ｂ逡逑的过表达程度。结果显示所选细胞株中ＶＰＳ３３Ｂ表达量均明显上调，，证明逡逑ＶＰＳ３３Ｂ慢病毒载体转染成功，适合进行下一步实验。检测结果如下所示：逡逑

第一章邋ＶＰＳ３３Ｂ促进鼻咽癌对５－氟尿嘧啶化疗敏感胞中ＥＧＦＲ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＡＫＴ表达量下调，ＰＩ３Ｋ＆ＡＫＴ总蛋白表达而其下游ｃ－Ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ１、ＣＣＮＤ１表达下调，ｐ５３表达上调。抑制ＶＰＳ３３察到相反结果。该结果表明ＶＰＳ３３Ｂ通过ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ调控其下、Ｐ５３、ｃ－Ｊｕｎ等细胞周期关键因子在鼻咽癌细胞中发挥抑制增殖的作用果如下所示：逡逑ＮＣ邋ＶＰＳ３３Ｂ邋ＮＣ邋ＶＰＳ３３Ｂ逦ＮＣ邋ＶＰＳ３３Ｂ邋ＮＣ邋ＶＰＳ３３Ｂ逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.63

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本文编号：2677092