利用靶向IL-23的小分子多肽预防自身免疫性葡萄膜炎

发布时间：2020-06-04 06:01

【摘要】：目的葡萄膜炎(uveitis)是眼科最常见的一种自身免疫性疾病。在我国葡萄膜炎的发病率一直居高不下,并且葡萄膜炎会导致不可逆性的失明,国外有研究表明约有10%的失明是由葡萄膜炎导致,因此葡萄膜炎一直是我国防盲重点。近年来研究发现,IL-23/Th17轴对于葡萄膜炎的致病起着十分重要的作用,其中IL-23是葡萄膜炎发病关键的细胞因子,c-Rel/IL-23/IL-17通路与包括葡萄膜炎在内的自身免疫性疾病的发生和发展紧密相关。本研究的目的在于设计一种能够特异性识别转录因子c-Rel在IL-23p19基因启动子上的结合位点的小分子多肽抑制剂,从而抑制IL-23p19的表达,减少致病性Th17细胞的数目以起到预防葡萄膜炎的目的。这将为包括自身免疫性葡萄膜炎在内的自身免疫性疾病的防治提供新的思路。方法1.构建包含IL-23p19κ1片段启动子载体,进行双荧光素酶检测。研究小分子多肽抑制剂对于IL-23p19启动子活性的影响。2.诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞,用或不用小分子多肽抑制剂处理。研究小分子多肽抑制剂是否影响IL-23p19的表达。3.用小分子多肽抑制剂处理或不处理BMDC、BMDM、T细胞,通过ELISA检测细胞上清中IL-12、IL-6等细胞因子的浓度。研究小分子多肽抑制剂是否特异性的影响IL-23p19的表达。4.用小分子多肽抑制剂处理或不处理BMDC、293T等细胞,通过细胞活性检测。研究小分子多肽抑制剂对于细胞生长是否有毒性。5.用吖啶橙活细胞染料将小分子多肽抑制剂处理过的细胞染色,用荧光显微镜观察。研究小分子多肽抑制剂是否能够进入细胞核。6.构建小鼠EAU模型,尾静脉注射一定浓度的小分子多肽抑制剂或DMSO。通过观察小鼠眼球病理切片并评分判断建模是否成功,脾脏、眼球等细胞经过一定的刺激后,收集上清用ELISA检测炎症因子IL-17A、IL-23的表达。研究小分子多肽抑制剂能否预防自身免疫性葡萄膜炎。结果1.通过构建包含IL-23p19κ1片段启动子载体,进行双荧光素酶检测的结果证明小分子多肽抑制剂在体外能抑制IL-23p19启动子的活性,差异具有统计学意义(**P0.01)。2.通过用或不用小分子多肽抑制剂处理BMDC,通过ELISA和Q-PCR检测,结果证明小分子多肽抑制剂可以在蛋白质水平和mRNA水平抑制IL-23p19表达,差异具有统计学意义(**p0.01,***p0.001)。3.通过用或不用小分子多肽抑制剂处理BMDC、BMDM、T细胞,用ELISA检测IL-12、IL-6等细胞因子,结果显示各细胞因子浓度没有明显差异(P0.05)。4.通过用小分子多肽抑制剂处理或不处理BMDC、293T等细胞,进行细胞活性检测。结果显示各种细胞活性没有明显差异(P0.05)。5.荧光显微镜结果显示小分子多肽抑制剂能够进入细胞核。6.通过构建小鼠EAU模型,尾静脉注射一定浓度的小分子多肽抑制剂或DMSO。结果显示,小分子多肽抑制剂组视网膜病理评分低于DMSO组,差异具有统计学意义(*P0.05)。小分子多肽抑制剂组脾脏、眼球等细胞上清液中炎症因子IL-17A、IL-23低于DMSO组,差异具有统计学意义(*P0.05,**P0.01)。结论1.小分子多肽抑制剂显著抑制IL-23p19表达。2.小分子多肽抑制剂不影响其它细胞因子的表达。3.小分子多肽抑制剂处理对细胞生长没有明显毒性作用。4.小分子多肽抑制剂可以以IL-23p19为靶点来预防葡萄膜炎。
【图文】：

图 1 小分子多肽结构.2 小分子多肽显著抑制 IL-23p19 表达.2.1 小分子多肽处理显著抑制 IL-23p19 启动子的活性通过将构建的含有 IL-23p19κ1 片段启动子的载体，用转染试剂转染 Raw264.，并用四种不同条件刺激：100nM 小分子多肽；100nM DMSO；100ng/ml LPS+1分子多肽；100ng/ml LPS+100nM DMSO。进行双荧光素酶检测。结果显示，小肽能有效抑制 IL-23p19 启动子的活性(图 2）。在没有 LPS 刺激（M 组）的情况下子多肽组和 DMSO 组没有明显的差异。但当有 LPS 刺激（LPS 组）时，小分子能明显抑制 DMSO 组 IL-23p19 启动子的活性，差异具有统计学意义（**P＜0.明小分子多肽能有效抑制 IL-23p19 启动子的活性。

图 2 小分子多肽处理显著抑制 IL-23p19 启动子的活性处理在 mRNA 水平抑制 IL-23p19 的表达多肽在体内对 IL-23p19 mRNA 表达的影响，我们利M、10 nM、100 nM、1000 nM）处理小鼠骨髓来源树突中。用 1ug/ml LPS 刺激，6 小时后收集细胞，提取YBR qPCR Mix 进行实时定量 PCR（RT-PCR），以达。结果显示（图 3）：经过小分子多肽处理后，树3p19 mRNA 明显下调，差异明显，差异具有统计学意分子多肽能有效抑制 IL-23p19mRNA 的表达。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R773

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本文编号：2695987