自噬抵抗细胞上皮—间叶样表型转化进程维持视网膜色素上皮稳态

发布时间：2020-06-04 17:35

【摘要】：目的:增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)是孔源性视网膜脱离(Rhegmatogenous retinal detachments,RD)术后的严重并发症,也是造成手术失败的最主要原因。从其最初被详细阐述至目前为止,尚无有效的相关临床治疗进展。虽然PVR可以发生在术前,但其在任何种类的眼内RD手术干预后,都具有更高的发病率,PVR在所有RD术后的发病率为5-10%。脱离的视网膜及玻璃体后界膜表面的增殖膜为PVR的病理特征,其收缩导致的视网膜扭曲及持续脱离将孔源性视网膜脱离转变为牵引性视网膜脱离。在这种病理进程中,视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium,RPE)通过上皮-间叶样表型转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)丢失上皮特征,而获得间叶细胞表型,增加了细胞的迁徙能力、侵袭性、抵抗凋亡能力、以及细胞外基质的生成,使RPE转变为成纤维样细胞。基于PVR的这种最主要的细胞学特征,很多研究者付出了40余年的努力去探索,但仍未找到有效的预防及治疗PVR的方法。因此,我们推测,RD及PVR形成过程中有多种分子生物学机制参与其中。自噬是调节降解非必需或者功能障碍细胞器或蛋白质的细胞内分解代谢过程。通过自噬机制细胞可以消化损伤的蛋白质分子或者细胞器,从而确保维持细胞内环境稳态。然而,自噬也被认为是细胞对抗细胞内或者环境压力的策略,这包括营养剥夺,缺氧及药物影响。降解细胞器是细胞获得能量供给及基本代谢物质的替代机制。在眼内,从最前部的角膜到后部的给视网膜提供保护屏障的RPE,几乎所有的细胞类型都依赖一种或多种类型的自噬去维持正常的结构及生理功能。而且,自噬相关蛋白在眼部不同细胞中的表达也阐明了自噬进程在维持健康视功能中的重要性。相反,相关自噬基因的突变也可直接导致眼部疾病的发生,同时,眼内细胞稳态也依赖于通过基础与压力的相互作用诱导的自噬通路进行调节。视网膜RPE细胞及光感受器细胞中,自噬是被高度激活的,自噬功能的损害可导致RPE细胞早期退化变性。RPE的这些特征将自噬与视网膜衰老性疾病及光损伤导致的视网膜退行性疾病紧密关联。这使得自噬与视网膜疾病的研究热点集中在例如年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)等退行性病变中。自噬与EMT因为各自相对独立的作用机制,导致疏远的关联性,而不能被联系起来。然而,近来研究揭示,这两种重要进程可通过复杂的关系相互调控。我们发现,在视网膜疾病的发生发展过程中,自噬除了可以保护RPE细胞抵御氧化应激等压力刺激,阻止视网膜退化变性外,自噬也参与了RPE细胞的EMT进程。在TGF-β体外诱导RPE细胞EMT进程中,促进了细胞自噬行为的发生,但这种非生存压力导致的细胞自噬行为的作用机制尚不清楚,需要进一步论证,这也是本研究尚需解决的关键问题。我们推测自噬通路可能在PVR病理进程中起到重要调控作用,而这种调控机制的阐明将为PVR的预防及治疗提供新思路。方法:1、构建自噬相关基因7(Atg7)缺失的视网膜色素上皮细胞系,应用Western blot检测细胞中occludin,ZO-1表达的变化,观察细胞平面及三维空间中生长状态,检测α-SMA表达及定位的变化,初步探讨自噬与RPE细胞EMT的关系。2、TGF-β诱导RPE细胞EMT模型的建立:体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,给予不同浓度及时间梯度TGF-β刺激,通过Western blot及细胞免疫荧光实验分别检测,上皮表型因子:Claudin-1,间叶样表型因子:N-cadherin,及细胞骨架结构蛋白、应力纤维蛋白:α-SMA、Vimentin,的表达变化,寻找TGF-β诱导RPE细胞发生EMT的适合浓度及时间,确定RPE细胞上皮表型及间叶表型特征分子。3、检测RPE细胞EMT进程中自噬流的变化:不同时间梯度TGF-β刺激条件下,Western blot检测自噬相关蛋白Atg7表达变化;通过检测p62及LC3变化探讨自噬流及自噬体形成的影响,构建GFP-LC3真核表达载体,并外转入ARPE-19,荧光倒置显微镜观察并记录活体细胞中GFP-LC3点状聚集情况;应用溶酶体抑制剂CQ阻断自噬-溶酶体复合物降解,通过Western blot检测,明确TGF-β在RPE细胞中对自噬流的影响。4、检测自噬在调控RPE细胞EMT进程的作用:4.1分别以Serum starvation及Rapamycin为刺激条件,诱导细胞自噬的发生,检测自噬相关蛋白Atg7,p62及LC3表达变化,Western blot及细胞免疫荧光实验检测上皮表型因子Claudin-1,间叶样表型因子N-cadherin表达变化,探讨其与自噬行为的相关性。4.2体外构建Atg7 RNAi及control RNAi干扰载体,经质粒纯化提取,慢病毒载体包装系统共转染病毒包装细胞293T,感染RPE细胞,构建稳定沉默Atg7基因表达的ARPE-19细胞系。从而得到自噬缺陷的RPE细胞,检测Claudin-1及N-cadherin蛋白的表达;Transwell检测细胞迁移能力;体外凝胶收缩实验检测RPE细胞收缩能力。4.3构建Myc-Atg7质粒表达载体,分别于野生型ARPE-19细胞系及Atg7shRNA细胞系瞬时转染Atg7,检测Claudin-1及N-cadherin蛋白的表达。通过挽救实验进一步明确自噬对RPE细胞EMT的调控作用。4.4应用TGF-β及自噬诱导剂Rapamycin,Western blot及细胞免疫荧光实验分别检测自噬诱导剂Rapamycin对TGF-β引起EMT的挽救作用;Transwell实验检测细胞迁移能力的改变;体外凝胶收缩实验检测RPE细胞收缩能力的改变。5、探索自噬调控EMT发展的分子机制:提取小鼠WT MEF及Atg7~(-/-)MEF细胞,应用免疫共沉淀方法检测在TGF-β及HBSS饥饿条件刺激下,EMT上游关键转录调控因子Twist与p62的结合变化。结果:1、Atg7缺失导致RPE细胞纤维化发生。2、成功构建RPE上皮细胞层EMT模型,TGF-β刺激条件下,细胞间紧密连接蛋白Claudin-1表达降低,间叶性标志物:N-cadherin、α-SMA、Vimentin表达升高。细胞显纤维样改变。3、RPE发生EMT进程中,细胞自噬被激活,p62表达下降,LC3-II表达升高,细胞内GFP-LC3发生聚集。4、成功构建了Atg7的真核表达载体;构建了Atg7稳定敲减的ARPE-19细胞系,Atg7的敲减效率在70%以上。5、在通过敲减Atg7获得自噬缺陷的RPE细胞中,Claudin-1表达降低,间叶性标志物:N-cadherin,α-SMA、Vimentin表达升高;细胞迁移能力增强,收缩能力增强。6、给与自噬缺陷的RPE细胞过表达Atg7,Claudin-1的表达增加,而N-cadherin,α-SMA、Vimentin表达降低;给与正常RPE细胞无血清饥饿刺激,也可见细胞上皮特征的增强。7、在正常RPE单细胞层EMT进程中,通过给与Rapamycin促进细胞自噬,可以逆转TGF-β引起的Claudin-1降低,阻止N-cadherin、α-SMA、Vimentin表达升高,降低细胞迁移能力及收缩能力。8、Atg7敲除小鼠MEF细胞中,对比野生型小鼠MEF细胞,p62明显积累,LC3-II型表达明显减弱;同时间叶性蛋白表达明显升高。9、野生型小鼠MEF细胞给与HBSS或无血清饥饿刺激,可见细胞间叶性蛋白标志物的明显降低。对比Atg7~(-/-)MEF细胞,同时给与无血清饥饿刺激,可见WT MEF细胞间叶性蛋白降低,而自噬功能缺陷细胞无明显改变。10、免疫共沉淀实验结果揭示,在TGF-β作用下,p62与Twist结合不增加,而在HBSS饥饿条件下与Twist结合明显增加。结论:1、自噬是维持视网膜色素上皮细胞正常上皮形态的关键通路。2、促进自噬可以保护RPE抵抗EMT压力,维持正常细胞间紧密连接结构,逆转细胞纤维化进程,维持RPE细胞内环境稳态。3、p62介导的选择性自噬,通过与Twist结合,介导Twist的降解,从而抵抗EMT的发展进程。我们的研究为自噬与视网膜色素上皮细胞纤维化性疾病的关系提供了更完整的理解,为自噬可能成为PVR治疗靶点提供了新观点。
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细胞株,慢病毒,博士学位论文,统计学意义

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 稳定敲减 ATG7 的 ARPE-19 细胞株的构建shATG7#1 及 shATG7#2 质粒经慢病毒包装后，感染 ARPE-19 细胞株，通过Western blotting 检测 ATG7 蛋白表达量，结果如图 1 所示，shATG7#1 组及 shATG7#2组与 shNC 组相比，ATG7 蛋白表达明显降低。条带灰度值分析后，分别与 shNC 组相比，P＜0.01，差异有统计学意义。

细胞形态,细胞融合,细胞,上皮细胞

图 2 稳定敲减 ATG7 后 ARPE-19 细胞中 occludin 及 ZO-1 的蛋白表达量A, Western blotting analysis of occludin and ZO-1 in shNC and shATG7 ARPE-19 cells. BQuantification of the band intensities of occludin and ZO-1 obtained by Western blotting analysis asin panel (A), expressed as the means±S.D., **P<0.01 vs shNC.3.3 稳定敲减 ATG7 后 ARPE-19 细胞形态的变化体外分别培养 shNC 组，shATG7 组细胞，，待细胞融合后继续培养 3 天，观察细胞形态。如图 3 所示，与 shNC 组相比，shATG7#1 与 ATG7#2 细胞明显失去整齐排列的上皮细胞形态，成纤维样改变。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.1

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