β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化调控鼻咽癌中CDH1基因转录和表达的研究

发布时间：2020-06-04 21:19

【摘要】：研究背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是发生于鼻咽黏膜的上皮性恶性肿瘤。鼻咽癌在大部分发达国家地区很罕见,发病率低于1/10万(人/年),而在我国华南地区及东南亚地区,其发病率高至10-25/10万(人/年)。鼻咽癌的发生是一个多步骤、多因素相互作用的过程,其病因主要包括遗传易感性、EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染和环境致癌。目前鼻咽癌的主要治疗手段是以放射治疗为主的综合治疗。随着治疗手段的不断优化,鼻咽癌患者的总五年生存率已达到80%以上,但仍有部分患者出现肿瘤的局部复发和远处转移而治疗失败。因此,探索鼻咽癌的发病机制,寻找新的治疗靶点和手段具有重要意义。能量代谢异常是肿瘤的十大标志性特征之一。在肿瘤发生发展过程中,其能量代谢发生了显著改变,包括糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环、氧化磷酸化等代谢模式的改变,其中以糖代谢异常的报道居多。除了糖代谢异常,脂肪酸代谢异常也日益成为肿瘤代谢研究的热点。酮体是脂肪酸代谢的下游产物之一,其对肿瘤的恶性生物学行为影响目前还尚不明确。本课题组在前期研究中发现,生酮路径关键基因羟甲基戊二酰辅酶A裂解酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A,HMGCL)在鼻咽癌中表达下调,提示鼻咽癌中存在着酮体代谢异常。β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,β-HB)是酮体的主要成分之一,具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的活性,可通过调控组蛋白乙酰化修饰水平影响基因组的转录水平,已被发现参与一些肿瘤的发生与发展。目前,β-羟丁酸代谢异常对鼻咽癌的发生发展的影响及其具体机制尚未明确。我们前期研究证实,在鼻咽癌细胞中过表达HMGCL基因可增加鼻咽癌细胞内β-羟丁酸含量,从而通过逆转上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用抑制细胞迁移和侵袭的能力。我们还发现内、外源性β-羟丁酸均能显著增加鼻咽癌细胞CDH1基因编码的上皮性钙黏蛋白E-cadherin的表达水平。作为钙粘蛋白家族成员,E-cadherin对维持上皮细胞的极性和细胞间的黏连性起着关键的作用,其表达下调也是肿瘤EMT的重要分子标志物,预示肿瘤的恶性进展。CDH1基因是调控鼻咽癌浸润转移的关键分子之一,鼻咽癌中CDH1的表达失活可由于mi RNA靶向调控、启动子高甲基化修饰等机制调控。而β-羟丁酸调控鼻咽癌CDH1基因的转录和表达的机制仍不清楚。研究目的:以CDH1基因为例,探究β-羟丁酸通过影响组蛋白乙酰化水平对鼻咽癌细胞表观基因组的调控及其分子机制。研究细胞代谢对鼻咽癌表观遗传学的影响,探讨鼻咽癌发生发展的分子机制。研究方法:1.利用荧光法检测β-羟丁酸对鼻咽癌组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)活性的影响。2.利用Western blot方法检测β-羟丁酸对鼻咽癌组蛋白乙酰化的影响。3.分别通过荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和Western blot实验检测β-羟丁酸对鼻咽癌细中CDH1基因转录和表达水平的影响。4.利用染色质免疫共沉淀检测方法(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)检测β-羟丁酸对鼻咽癌细胞中CDH1启动子区域组蛋白乙酰化水平的影响。5.联合染色质免疫共沉淀高通量测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,Ch IP-seq)和RNA转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)描绘β-羟丁酸对鼻咽癌细胞表观基因组的影响。研究结果:1.β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性。经β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞5-8F、HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV组蛋白去乙酰化酶活性显著降低,其抑制的倍数分别为1.470(P=0.000)、1.091(P=0.002)、1.097(P=0.078)、1.400(P=0.000)倍。结果表明,β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞中的组蛋白去乙酰化酶。2.β-羟丁酸上调鼻咽癌细胞的组蛋白乙酰化水平。经不同浓度β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞(5-8F、HONE1、CNE2-EBV、HK1-EBV)中乙酰化组蛋白H3(Lys9/Lys14)(Acety-H3(K9/14))、乙酰化赖氨酸(Acety-Lys)相对表达量较未经处理的鼻咽癌细胞显著上调。其中,按β-羟丁酸浓度梯度的递增(5,10,20m M),5-8F细胞中Acety-H3(K9/14)上调的倍数分别为1.767、1.182、1.342倍,HK1-EBV细胞中上调的倍数分别为1.195、1.537、1.866,CNE2-EBV细胞中上调的倍数分别为1.372、1.537、1.408倍,说明β-羟丁酸促进鼻咽癌细胞的组蛋白乙酰化水平。3.β-羟丁酸促进鼻咽癌CDH1的转录和表达水平。经β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞(5-8F、HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV)中CDH1基因的转录水平显著上调,转录水平随其浓度梯度的递增(5,10,20m M),在5-8F细胞中上调的倍数分别为1.988、2.207、3.227、5.313倍,HONE1中上调倍数分别为1.102、1.412、1.711、1.883倍,HK1-EBV中分别为0.763,1.120,1.384,1.577倍,CNE2-EBV细胞中分别为0.835,0.996,1.286,2.615倍,说明β-羟丁酸可促进鼻咽癌细胞CDH1基因的m RNA的转录水平。β-羟丁酸处理后5-8F细胞的E-cadherin蛋白的表达水平显著提高,而HONE1、HK1-EBV、CNE2-EBV细胞处理后的E-cadherin蛋白表达水平无显著变化。4.β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化促进鼻咽癌细胞中CDH1的表达。通过染色质免疫共沉淀实验,发现β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞5-8F、HONE1 Input%高于对照组,升高幅度分别为125.093和1.116倍,P值分别为0.000和0.494,结果表明β-羟丁酸促进CDH1启动子区组蛋白的乙酰化水平,提示β-羟丁酸通过组蛋白的乙酰化促进鼻咽癌细胞中CDH1基因的表达。5.高通量筛选β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化上调鼻咽癌细胞中的基因表达谱。通过转录组测序技术及生物信息学分析,发现β-羟丁酸处理前后鼻咽癌细胞5-8F中有1294个差异基因;而通过染色质免疫共沉淀测序,发现β-羟丁酸处理前后5-8F细胞的组蛋白乙酰化修饰差异的基因一共有1295个差异基因。综合分析确定5-8F细胞中β-羟丁酸通过增加组蛋白的乙酰化而促进转录表达的基因共有32个,从而初步建立了鼻咽癌细胞中β-羟丁酸通过组蛋白乙酰化修饰调控的基因谱。研究结论:1.β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞组蛋白去乙酰化酶的活性,是组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。2.β-羟丁酸可促进鼻咽癌细胞中组蛋白乙酰化水平。3.β-羟丁酸可增加鼻咽癌细胞中5-8F、HONE1、HK1-EBV的CDH1的转录和表达水平。4.β-羟丁酸通过组蛋白的乙酰化促进鼻咽癌细胞中CDH1的表达。5.筛选出32个β-羟丁酸靶向组蛋白的乙酰化调控的基因。综上,β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞的组蛋白去乙酰化酶活性,促进鼻咽癌细胞组蛋白乙酰化水平,并通过促进鼻咽癌细胞CDH1启动子区组蛋白的乙酰化水平,由此上调CDH1的转录和表达,此外,还筛选确立了β-羟丁酸靶向组蛋白的乙酰化调控的基因谱式。
【图文】：

组蛋白去乙酰化酶,鼻咽癌细胞

SS 22.0 软件对所得数据进行统计学分析，采用独立样本 T Test 分*p<0.05、** p<0.01、***p<0.001 为具有统计学意义。果 β-羟丁酸抑制鼻咽癌细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性。为了检测β-羟丁酸对鼻咽癌组蛋白去乙酰化酶活性的影响，我β-羟丁酸处理 4 株鼻咽癌细胞（5-8F、HONE1、HK1-EBV 和E2-EBV），用荧光法检测发现：全部 4 株鼻咽癌细胞在处理后β-酸组蛋白去乙酰化酶活性显著降低，其抑制的倍数分别为70(P=0.000)、1.091(P=0.002)、1.097(P=0.078)、1.400(P=0.000)倍。β-羟丁酸可抑制鼻咽癌细胞中组蛋白去乙酰化酶活性，具有组蛋乙酰化酶抑制作用（图 1-1）。

鼻咽癌细胞,组蛋白,乙酰化,组蛋白乙酰化

2.2 β-羟丁酸上调鼻咽癌细胞的组蛋白乙酰化水平。为进一步验证β-羟丁酸对鼻咽癌组蛋白乙酰化水平的影响，通过Western blot 方法发现，经不同浓度β-羟丁酸处理的鼻咽癌细胞（5-8FHONE1、CNE2-EBV和HK1-EBV）中的乙酰化组蛋白H3（Lys9 / Lys1（Acety-H3(K9/14)）相对表达量较未经处理的鼻咽癌细胞显著上调且上调水平按β-羟丁酸浓度梯度的递增（5，，10，20mM），Acety-H3K9/14 在 5-8F 细胞中上调的倍数分别为 1.767、1.182、1.34倍，在 HK1-EBV 细胞中上调的倍数分别为 1.195、1.537、1.866,在CNE2-EBV 细胞中上调的倍数分别为 1.372、1.537、1.408 倍，进一步说明β-羟丁酸上调鼻咽癌细胞的组蛋白乙酰化水平（*p＜0.05, **＜0.01，***p＜0.001，图 1-2）。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.63

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