慢病毒ShRNA干扰PGC-1α表达在DR中的作用

发布时间：2017-03-27 09:09

  本文关键词：慢病毒ShRNA干扰PGC-1α表达在DR中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究通过检测在AGEs环境中人脐静脉内皮细胞株EA.hy926、RPE细胞株ARPE-19以及DM大鼠视网膜中PGC-1α、VEGF、及EGR-1的表达变化,探究PGC-1α在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用,及PGC-1α、VEGF与EGR-1间的关系,为DR的发生发展及治疗提供一定理论依据。方法确定PGC-1αsi-RNA序列:sense,5’-AAGACGGAUUGCCCUCAUUUGtt-3’;antisense,5’-CAAAUGAGGGCAAUCCGUCUUtt-3’。合成含PGC-1α序列的单链DNA,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆即为构建成功PGC-1αRNAi慢病毒载体。取生长状态良好的内皮细胞与RPE细胞,经AGEs(1g/L)干预4d后,加入慢病毒包装的PGC-1αSh RNA感染后,分普通培养液培养及AGEs持续培养,具体实验分组如下:A.普通培养液培养;B.AGEs培养(1g/L);C.AGEs培养4天后PGC-1αRNA干扰1.继而更换正常培养液培养;2.持续AGEs(1g/L)培养。检测慢病毒对内皮细胞、RPE细胞的感染率。采用免疫细胞化学检测各组细胞PGC-1α、VEGF及EGR-1的表达情况。提取细胞总RNA,应用RT-PCR检测PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,进行数据归纳和统计学分析。SD大鼠腹腔注射STZ制作糖尿病模型。对DM大鼠行玻璃体腔注射慢病毒包装的PGC-1αsh RNA,具体实验分组:A.正常组(10只)B.糖尿病组(1.糖尿病4W组(10只)2.糖尿病8W组(10只))C.RNAi组(1.DM 4周玻璃体腔注射PGC-1α干扰RNA10天后取材(10只)2.DM 8周玻璃体腔注射PGC-1α干扰RNA10天后取材(10只))。观察大鼠玻璃体腔转染情况:玻璃体腔注射一周后,行眼球冰冻切片,荧光显微镜下观察sh RNA慢病毒对视网膜转染情况。采用免疫组织化学检测各组大鼠视网膜PGC-1α、VEGF及EGR-1的表达情况。提取大鼠视网膜总RNA,应用RT-PCR检测PGC-1α、VEGF及EGR-1的含量,进行数据归纳和统计学分析。结果阳性重组子测序结果序列比对完全正确,表明靶向PGC-1α的RNA干扰慢病毒制备成功。靶向PGC-1α的慢病毒Sh RNA转染293T细胞2天后,在荧光显微镜下观察同一视野的荧光和可见光照片,可见慢病毒转染率高达95%以上。在MOI=100 polybreen(+)时内皮细胞和RPE细胞感染效果好,感染率达80%—85%。免疫细胞化学与实时荧光PCR检测结果显示在正常内皮细胞与RPE细胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表达,内皮细胞与RPE细胞在AGEs培养后PGC-1α、VEGF与EGR-1在蛋白及m RNA水平升高,组间差异有统计学意义(p0.05);在使用慢病毒Sh RNA干扰PGC-1α后更换普通培养液培养,PGC-1α、VEGF与EGR-1均较AGEs培养后下降(p0.05);继续使用AGEs培养,PGC-1α、VEGF与EGR-1表达虽比AGEs培养组下调(p0.05),但仍较更换普通培养液组升高(p0.05)。玻璃体腔注射后视网膜转染率高,荧光显微镜下观察显示高荧光。免疫组织化学与实时荧光PCR检测结果显示糖尿病组PGC-1α、VEGF与EGR-1较正常组在蛋白及m RNA水平升高,组间差异有统计学意义(p0.05),且PGC-1α和VEGF的表达均随病程进展而表达增加。RNAi组PGC-1α蛋白及m RNA水平均较糖尿病组下降(p0.05),VEGF与EGR-1在玻璃体腔注射慢病毒Sh RNA干扰PGC-1α后较同病龄糖尿病组未见明显改变。结论1.在正常内皮细胞与RPE细胞中存在少量PGC-1α、EGR-1及VEGF表达,AGEs环境下内皮细胞与RPE细胞中PGC-1α、EGR-1及VEGF表达均明显升高。2.使用PGC-1αSh-RNA慢病毒转染经干预AGEs过的细胞后,细胞中PGC-1α在蛋白与m RNA水平表达均下调至正常水平,同时EGR-1和VEGF在蛋白与m RNA水平表达也下调至正常水平。可见PGC-1α与EGR-1、VEGF在内皮细胞与RPE细胞中表达存在正相关。3.即使经PGC-1αSh-RNA慢病毒干扰,但若内皮细胞与RPE细胞仍持续处于AGEs环境中,PGC-1α、VEGF与EGR-1表达虽较AGEs培养组下调,但仍无法回归到正常水平,推断因AGEs的堆积造成“代谢记忆”。4.在DM大鼠视网膜中PGC-1α、EGR-1及VEGF表达均明显上调,且PGC-1α与VEGF的表达随DM病程进展而增加。5.在对DM大鼠进行RNA干扰后,大鼠视网膜中PGC-1α较同病龄的DM大鼠下调,但EGR-1和VEGF与同病龄的DM大鼠比较无明显变化。推测因体内环境复杂,DM发生后在多信号通路启动及“代谢记忆”产生的情况下,EGR-1及VEGF表达无法回到正常水平。
【关键词】：糖尿病视网膜病变 PGC-1α RNA干扰 VEGF EGR-1
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R774.1
【目录】：

• 英文缩略一览表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一部分 PGC-1α ShRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定11-15
• 前言11-12
• 材料及方法12-14
• 结果14-15
• 第二部分 慢病毒ShRNA干扰PGC-1α 在内皮细胞与RPE细胞中的表达15-35
• 前言15-17
• 材料及方法17-25
• 结果25-35
• 第三部分 慢病毒ShRNA干扰PGC-1α 在糖尿病大鼠视网膜中的表达35-47
• 前言35-36
• 材料与方法36-40
• 结果40-47
• 讨论47-53
• 结论53-55
• 参考文献55-59
• 综述59-68
• 参考文献64-68
• 致谢68

【参考文献】

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1 梁璇;丁新民;霍艳英;潘兴斌;隋建丽;白贝;徐勤枝;周平坤;;ERK1/2-Sp1信号通路对肺癌细胞VEGF的调控作用[J];癌变.畸变.突变;2007年04期

2 陈淑娟;汪新宇;罗国春;薛耀明;;PGC-1α对高糖诱导的血管内皮细胞内ROS生成的影响[J];山东医药;2010年21期

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1 谢茂松;炎症因子在前节内眼手术诱发血视网膜屏障破坏中的作用及机制研究[D];山东大学;2008年

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本文编号：270169