阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者血浆外泌体在促进肺腺癌恶性进展中的功能和机制研究

发布时间：2020-06-11 01:27

【摘要】：目的:本研究目的在于检测阻塞性睡眠呼吸暂停低通气病人血浆外泌体中mi RNA-33b-3p表达情况,探究外泌体mi RNA-33b-3p/AXL在其影响肺腺癌细胞增殖以及迁移能力中的作用。方法:(1)收集OSA病人以及健康体检者外周血,从中分离外泌体,以Western blot检测其特殊外泌体蛋白Hsp70、CD63、CD9的表达,再通过Nanosight纳米颗粒分析技术和透射电镜鉴定其形态,同时进一步使用q PCR检测两组外泌体mi RNA-33b-3p的表达差异。(2)通过PKH26标记外泌体与肺腺癌细胞A549细胞系共同孵育鉴定外泌体可被A549细胞摄入发挥功能。同时用荧光标记mi RNA-33b-3p转染A549细胞,取其包含特殊mi RNA的外泌体与普通A549细胞共同孵育。(3)将OSA病人组与健康人组外泌体分别孵育A549细胞,对比检测其对应的mi RNA-33b-3p水平与细胞增殖、迁移能力。(4)为验证mi RNA-33b-3p在影响A549细胞恶性进展的作用,以mi RNA-33b-3p模拟物转染A549细胞,对比对照组检测其增殖、迁移能力。(5)为验证AXL为mi RNA-33b-3p作用蛋白并在mi RNA-33b-3p引起A549细胞恶性增加中的作用,行荧光素酶报告基因实验检测以及细胞实验。同时在A549细胞中转染mi RNA-33b-3p抑制剂减弱其调节功能的同时,干扰AXL蛋白的表达,探究不同情况下靶细胞增殖和迁移能力以此进一步验证AXL在mi RNA-33b-3p影响A549细胞恶性进展通路中的作用。结果:(1)从OSA病人及健康体检者外周血浆分离外泌体,可见其直径集中在130nm左右,WB检测两组均可见CD63、CD9、Hsp70表达。q PCR检测OSA病人表达mi RNA-33b-3p较健康体检组少。(2)外泌体mi RNA可随外泌体一起被A549细胞摄入。(3)OSA病人外周血外泌体较健康体检者可促进其共同孵育靶细胞的增殖能力及迁移能力。(4)mi RNA-33b-3p可减弱A549细胞的增殖和迁移能力。(5)AXL蛋白是miRNA-33b-3p减弱A549细胞恶性进展的直接作用蛋白。结论:OSA病人外周血外泌体mi RNA-33b-3p相对于健康人表达减少,外泌体-mi RNA-33b-3p/AXL通路是OSA病人促进肺腺癌细胞增殖以及迁移增加的机制之一。
【图文】：

电镜,病人,纳米,形态

图 1 A：外泌体电镜下形态；B：OSA 病人与健康体颗粒跟踪分析结果；C：OSA 组与正常组外泌体蛋白D：正常组与 OSA 组外泌体 miRNA-33b-3p 表达差3.2 外泌体及其内容 miRNA-33b-3p 可以由外泌体可在细胞分泌后随血液流遍全身各处，为摄取，研究中将 PKH26 与外泌体共同孵育，并将此育，共聚焦显微镜下可见 A549 细胞含有特殊红色荧胞摄入了较多外泌体。miRNA 是一种容易被环境降泌体中，可以对其有一定的保护作用。为进一步验证泌体一起进入靶细胞，我们将荧光标记的 miR-33b 转生的外泌体，再与普通 A549 细胞共同孵育，在共A549 细胞，可见其内有红色荧光（图 2B），，表明 m

共聚焦,共聚焦显微镜,红色荧光,图像

图 2 A:与特殊外泌体共同孵育后共聚焦图像；B：A549 与含红色荧光标记miR-33b 外泌体共聚焦显微镜图像3.3 OSA 病人外周血外泌体可促进 A549 细胞的增殖能力及迁移能力将 OSA 病人外周血外泌体与 A549 细胞共同孵育，然后通过 CCK8 实验Transwell 实验可知，相对于健康对照组外泌体，其可显著促进 A549 细胞的增殖能力和迁移能力。而且可见其中 OSA 外泌体孵育组细胞中 miRNA-33b 表达量小于健康对照组。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R766;R734.2

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