K-115调控自噬抑制人Tenon’s囊成纤维细胞活化

发布时间：2020-06-13 13:13

【摘要】：目的:采用组织块贴壁法培养原代人Tenon's囊成纤维细胞(Human Tenon's Fibroblasts,HTFs),用转化生长因子-β1(Transforming Growth Factors-β1,TGF-β1)诱导细胞,建立HTFs活化的模型,进而研究Rho蛋白激酶(Rho Kinase,ROCK)抑制剂K-115对HTFs活化的调控作用,并探讨其相关机制。为K-115抑制青光眼滤过性手术(Glaucoma Filtering Surgery,GFS)后瘢痕形成提供细胞水平上的理论支持。方法:1在术中取青光眼患者的Tenon's囊组织,采用组织块贴壁法培养原代HTFs。2建立TGF-β1诱导HTFs活化的细胞模型。用CCK-8法检测TGF-β1最适的作用浓度和时间。3研究K-115对HTFs活化的影响,用不同浓度的K-115预处理HTFs2小时,然后再用最适浓度的TGF-β1来诱导HTFs;CCK-8法测定K-115预处理对TGF-β1诱导HTFs活化后的增殖能力的影响,确定K-115作用的最适浓度;Transwell法研究K-115预处理对TGF-β1诱导HTFs活化后的迁移能力的影响;免疫荧光法检测K-115预处理对TGF-β1诱导HTFs活化后细胞内ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑSmooth Muscleactin,α-SMA)表达的影响。4研究K-115调控HTFs活化的作用机制,通过Cyto-ID染色法、流式细胞术来研究不同浓度K-115预处理对TGF-β1诱导HTFs活化后细胞的自噬水平、凋亡水平的影响;进一步通过qRT-PCR法、Western blot法检测不同浓度K-115预处理对TGF-β1诱导HTFs活化后细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3表达量的影响。结果:1采用组织块贴壁法成功地培养了人Tenon's囊成纤维细胞。2建立了TGF-β1诱导HTFs活化的细胞模型。CCK8法结果表明TGF-β1的最适作用浓度为5ng/ml。24h是观察TGF-β1促进增殖作用的最适时间。3 CCK8法证实添加K-115组的细胞增殖能力较单纯TGF-β1组明显降低,K-115的最适作用浓度为10umol/L;Transwell迁移实验表明K-115可以抑制TGF-β1诱导细胞活化后的细胞迁移能力。细胞免疫荧光法证实TGF-β1诱导HTFs后细胞内ɑ-SMA的表达量明显增加,而经K-115预处理后细胞胞质中丝状荧光物质阳性表达较单纯TGF-β1诱导组明显减少;4 Cyto-ID染色法结果表明TGF-β1诱导HTFs活化后细胞的自噬水平上升,而经不同浓度(5umol/L、10umol/L)K-115预处理可以降低细胞活化后的自噬水平,且呈浓度依赖性;流式细胞术对细胞凋亡的检测结果表明K-115预处理对细胞的凋亡水平无明显影响。qRT-PCR法、Western blot结果提示不同浓度K-115预处理可以抑制TGF-β1诱导的自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的上调,且呈浓度依赖性。结论:ROCK抑制剂K-115对体外培养HTFs没有明显的毒性作用,可在一定程度上抑制TGF-β1对人Tenon's囊成纤维细胞的活化作用,其机制可能是调控了TGF-β1诱导的HTFs的自噬功能。
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R775

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本文编号：2711231