玻璃体腔注射二甲双胍对rd1小鼠视网膜变性的延缓作用及机制研究

发布时间：2020-07-03 02:47

【摘要】：背景和目的:视网膜变性(retinal degeneration,RD),包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD),是一类严重的致盲性眼病。其中RP的特征性病理改变是视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)进行性的变性、凋亡和丢失~([1])。到目前为止,已有超过95种致病基因被证明可通过常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X连锁遗传参与RP的发病过程(https://sph.uth.edu/retnet)。RP的发病率在不同人群中不尽相同~([2])。目前对于RP尚无有效的治愈方法。据报道,神经营养因子能够在有限的时间内挽救RPE和感光细胞使其免于凋亡,进而延缓RP进程~([3])。比如,视杆细胞源性视锥细胞生长因子(rod-derived cone viability factor,RdCVF)可减少P23H视网膜变性大鼠中视锥细胞的凋亡数量~([4])。此外,小胶质细胞的激活和继发性的炎症反应促进RP进程中RPE细胞和感光细胞的凋亡~([5]),是RP病变的重要因素。因此,通过抑制炎症反应或提供神经保护作用,从而保护感光细胞免于凋亡可能是抑制RP病理进程的重要手段。二甲双胍是一种双胍类的降糖药,被广泛应用于治疗2型糖尿病。现有研究证实二甲双胍在肥胖和肿瘤的发生中发挥抗炎作用,从而产生有益作用~([6])。最近有报道称,在3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(3,4-methylenedioxymethamphetamine,MDMA)诱导的多巴胺能神经变性和帕金森病~([7])中,二甲双胍能发挥显著的神经保护作用。长期使用二甲双胍能够通过降低AMP-活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)水平而降低中风的风险~([8]),证实了二甲双胍具有神经保护作用。二甲双胍急性预处理被证明可通过预激活AMPK依赖性自噬,在局灶性脑缺血中发挥显著的神经保护作用~([9])。在心脏骤停导致的缺血再灌注~([10])和全脑缺血~([11])中,二甲双胍被发现可改善神经功能,其作用机制与AMPK的调控有关。有研究证实,在中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤和退行性病变中,二甲双胍主要通过AMPK依赖性途径发挥神经保护作用。众所周知,AMPK是维持细胞能量产生和平衡的关键酶,而CNS利用的葡萄糖占全身总量的50%以上,可见AMPK在CNS的神经功能维持和神经元存活中尤为重要~([12])。近来有报道表明:二甲双胍也有可能通过非AMPK依赖途径发挥神经保护作用。在QUIN诱导的神经元兴奋性毒性损伤的细胞模型中,二甲双胍可抑制神经元内钙的增加,减少细胞凋亡~([13])。在甲基苯丙胺诱导的神经退行性病变大鼠模型中,二甲双胍通过激活Akt/GSK3和CREB/BDNF信号通路产生神经保护作用~([14])。这种机制在氧化应激所致的PC12细胞损伤中也得到了证实~([15])。在氧-葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经元损伤中,二甲双胍通过下调有丝分裂阻滞缺陷蛋白(mitotic arrest deficient 2-like protein 2,MAD2B)的表达而发挥神经元保护作用~([16])。最近发现,二甲双胍通过清除淀粉样蛋白斑块沉积而改善APP/PS1阿尔茨海默病小鼠的记忆障碍~([17])。此外,二甲双胍的这种非AMPK依赖的神经保护作用也在大脑缺血模型中得到证实~([18])。到目前为止,二甲双胍的神经保护作用机制尚未完全阐明。传统的AMPK依赖机制有时是自相矛盾的。例如,在细胞模型和P23H这一RP大鼠模型中,二甲双胍可改善RP模型P23H大鼠的视紫红质的运输,然而,由于二甲双胍改善的P23H的视紫红质的不稳定性,反而增加了感光细胞的死亡~([19])。除了P23H RP大鼠外,二甲双胍在其他RP模型中的作用尚不清楚。B6.C3-Pde6brd1Hps4le(rd1)小鼠是快速视网膜光感受器变性的动物模型,是由于视杆细胞中的cGMP磷酸二酯酶的β亚基(βsubunit of rod cGMP-phosphodiesterase,PDE6β)突变导致视网膜中cGMP积累~([20]),最终引发严重的早发性视网膜变性~([21])。rd1小鼠中的突变基因与人类致病基因同源,因此已被用作研究人类RP的模型超过30年~([22,23])。本研究主要探究玻璃体腔注射二甲双胍是否能够保护rd1小鼠的感光细胞,改善视功能,延缓其变性进程。通过转录组学和分子生物学方法探索二甲双胍对变性视网膜的作用机制,并采用离体实验进行验证。研究结果为探究RP的治疗方法提供依据。方法:第一部分:玻璃体腔注射二甲双胍对rd1小鼠视功能的影响1、出生后6天(P6)的rd1小鼠玻璃体腔注射二甲双胍或磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS),同天龄的C57BL/6J(C57)小鼠作为对照。在P9、P12时重复注射,共三次。2、P14、P18、P22时,用黑白箱行为学方法检测小鼠视功能。3、P14、P18、P22时,通过闪光视网膜电图(flash electroretinogram,FERG)检测小鼠视网膜功能。4、免疫组化检测小鼠视网膜凋亡细胞数量,外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度变化以及感光细胞、小胶质细胞和双极细胞的变化,并用蛋白印迹(western blot,WB)进行验证。第二部分:二甲双胍对rd1小鼠视网膜转录组的影响1、将P14的rd1小鼠视网膜进行RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq),以检测二甲双胍对其变性视网膜转录组的影响。2、根据测序结果分析二甲双胍延缓rd1小鼠视网膜变性的关键通路和基因。3、对测序筛选出的关键基因用RT-PCR验证,对核心基因——αA晶体蛋白用免疫组化和WB进一步验证。第三部分:二甲双胍对钙超载所致类感光细胞损伤的作用1、体外培养类感光细胞系661W,对其进行Ca~(2+)ionophore处理,制备钙超载细胞损伤模型。2、CCK8实验和TUNEL染色检测二甲双胍处理对钙超载的661W细胞活力和凋亡的影响。3、采用免疫荧光和WB技术检测二甲双胍处理对661W细胞中aA-晶体蛋白表达的影响。结果:第一部分:玻璃体腔注射二甲双胍对rd1小鼠视功能的影响1、黑白箱行为学结果显示,玻璃体腔注射二甲双胍显著延缓rd1小鼠视功能的下降,而对C57小鼠没有明显影响。FERG结果显示玻璃体腔注射二甲双胍使rd1小鼠b波幅值显著升高,a波幅值在部分光强下显著升高,对C57小鼠没有明显影响。2、免疫组化结果显示,玻璃体腔注射二甲双胍可显著减少rd1小鼠视网膜中凋亡细胞的数量,明显抑制外核层厚度变薄,而对C57小鼠无显著影响。在rd1小鼠视网膜中二甲双胍保护感光细胞,减少感光细胞凋亡,抑制小胶质细胞激活,但是对双极细胞没有明显影响。第二部分:二甲双胍对rd1小鼠视网膜转录组的影响1、RNA-seq结果显示,二甲双胍处理组和PBS处理组相比,共有337个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中上调的有291个,下调的有46个。2、京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径和蛋白质—蛋白质相互作用分析的结果表明:细胞因子—细胞因子受体相互作用、TGF-β信号通路、MAPK信号通路、凋亡通路和PI3K-Akt信号通路可能在二甲双胍延缓rd1小鼠视网膜变性过程中发挥着关键作用。晶体蛋白基因、凋亡相关基因(BIRC3,BIRC5和BAK1)和炎症相关基因(IL4,IL10和TGFB1)可能是其中重要的靶基因。结合GO(Gene Ontology)分析结果,我们发现二甲双胍可能通过神经保护、抗炎和抗凋亡作用保护rd1小鼠的视功能。免疫组化和WB结果进一步证实aA-晶体蛋白可能在二甲双胍对rd1小鼠视网膜变性的作用中发挥关键作用。第三部分:二甲双胍对钙超载所致类感光细胞损伤的作用1、二甲双胍保护钙超载所致的类感光细胞株661W细胞的损伤,显著减少钙超载造成的661W细胞凋亡。2、二甲双胍处理后得到保护的661W细胞中αA-晶体蛋白的表达量显著上调。结论:1、在rd1小鼠变性开始之前,玻璃体腔注射二甲双胍能够显著保护感光细胞,抑制小胶质细胞激活,从而保护视功能,延缓视网膜色素变性进程。2、二甲双胍可能是通过上调晶体蛋白的表达发挥神经保护和抗炎作用,进而延缓rd1小鼠视网膜变性的。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.13
【图文】：

模式图,行为学,小鼠,模式图

P12 时重复上述的操作。小鼠给药及检测流图 3-1 小鼠给药及检测时间线箱行为学检测相同液体（二甲双胍或 PBS）的小鼠避光过黑白箱行为学实验仪器设备（图 3-2）。黑白为 30×30×40 cm3，暗室规格为 15×30×40 cm之间的间隔上开设 10×10 cm2的开口，小鼠可且光强为 300lux。

二甲双胍,小鼠,视功能,暗室

C57 小鼠在暗室的时间之间无显著差异，提示二甲双胍不影响正常小鼠 C57 的视觉功能（图3-3 A）。和注射 PBS 的 C57 同龄小鼠相比，注射 PBS 的 rd1 小鼠在暗室中的时间明显减少，而玻璃体腔注射二甲双胍的 rd1 小鼠较注射 PBS 的 rd1 小鼠，在暗室中的时间显著增加（P<0.01）。二甲双胍的这一作用效果对 P18 的 rd1 小鼠仍然保持（P<0.05）。而 P22 时，二甲双胍延长 rd1 小鼠在暗室中时间的作用不再显著（P>0.05）。上述结果表明，在 P14 和 P18 时，二甲双胍改善了 rd1 小鼠的视觉功能。然而，在 P22 时

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