人乳头状瘤病毒感染在鼻内翻乳头状瘤中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-24 19:56

【摘要】：研究目的1.探讨HPV感染及其亚型与NSIP发生、发展及恶性转化的关系;2.探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活在HPV感染鼻咽部细胞中的作用。研究背景鼻及鼻窦内翻乳头状瘤(Nasal and sinonasal inverted papilloma,NSIP)是耳鼻喉科常见的良性肿瘤,具有局部侵袭性,其特点为鼻腔、鼻窦粘膜表层上皮细胞向间质内呈管状或指状深入并突破基底层。NSIP的病因及发病机制尚不清楚,但研究报道人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是其主要的危险因素。HPV是一类具有种族特异性的双链闭环DNA病毒,具有多种亚型,大量研究证明了HPV与多种肿瘤的形成、发展及预后密切相关。自1987年Syrjanen等首次在NSIP病例中鉴定出HPV,HPV感染在NSIP中的作用被广泛研究。文献报道了NSIP患者组织中HPV 阳性率显著高于正常组织,然而HPV病毒感染及其亚型与NSIP发生发展及恶性转化的关系鲜有报道。研究报道,HPV感染能通过多种信号途径作用于宿主细胞,促进细胞增殖及肿瘤发生。然而,HPV感染诱导NSIP的发生及恶性转化的机制尚不清楚。大量证据显示,HPV原癌基因E6/E7能有效激活磷脂酿肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路,通过诱导其靶基因表达的改变,激活MAPK信号通路,介导多种细胞及分子功能,对肿瘤的发生、发展及预后起着关键作用。其中,PI3K的激活能促进EGFR的表达,并导致MAPK/ERK信号的激活,Akt磷酸化及激活在HPV感染引起癌症中起着重要的作用,mTOR在细胞多种生物信号途径如生长因子感应、能量供应及营养状态中起着重要的调节作用。然而,PI3K/Akt/mTOR信号通路在HPV感染诱导的NSIP中的作用尚不清楚。研究方法1.NSIP与HPV感染及其亚型的关系研究收集山东淄博市中心医院病理科2005年8月-2017年6月正常(n=40)及NSIP患者(n=80)石蜡包埋组织样本;Logistic回归分析NSIP的危险因素;采用特异性PCR检测组织HPV E6/E7 DNA阳性率,通过HybirMax法采用基因分型导流杂交对HPV进行分型;HE染色观察组织病理;免疫组化检测组织pS6及pAkt蛋白的表达情况。2.PI3K/Akt/mTOR信号通路在HPV感染细胞中的作用及机制研究选取人正常鼻咽部上皮细胞系NP69-SV40T及人鼻咽癌细胞系CNE1用于细胞实验;构建HPVI11E6/E7质粒并转染至NP69-SV40T及CNE1细胞;CCK-8法测定质粒转染后或(和)加入mTOR抑制剂雷帕霉素后1-5 d细胞增殖活性;Annexin V-FITC/PI双染流式测定细胞凋亡;qRT-PCR检测HPV11 E6/E7质粒转染48 h后,TRIzol法提取细胞总RNA NP69-SV40T及CNE1 细胞PI3K、mTOR、Akt、S6、Caspase-3、cyclin D1、p53、p21 mRNA表达水平;提取细胞总蛋白,Western Blot分析质粒转染细胞PI3K、mTOR、Akt、S6、Caspase-3、cyclin Dl、p53、p21 蛋白及其磷酸化表达水平。研究结果1.NSIP与HPV感染及其亚型的关系研究80例NSIP患者平均年龄(50.9±14.3)岁(男性%=63.7%),40例对照者平均年龄(51.3±13.2)岁(男性%=60.0%);NSIP组HPV阳性率(47/80,58.8%)显著高于对照组(3/40,7.5%)(P0.001);HPV感染是NSIP发生的主要危险因素(OR=33.138,P0.001);中到重度不典型增生NSIP患者HPV 阳性率(78.3%)显著高于单纯NSIP或低度不典型增生患者(49.1%,6/53)(P0.05);Krouse Ⅲ期(75.0%)及Krouse IV期(85.7%)患者HPV阳性率显著高于Krouse Ⅰ期患者(37.5%,P0.05);47例HPV感染阳性样本共检出12个亚型,HPV11是检出最多的基因型(37.7%);NSIP合并SCC及中到重度NSIP患者高危型(33.3%及50.0%)及混合型(22.2%及66.7%)HPV感染率显著高于单纯NSIP或低度不典型增生组患者(36.0%及0.0%)(P0.05);Krouse Ⅲ期及Ⅳ期患者混合型(22.2%及50.0%)及高危型(55.6%及33.3%)HPV感染率显著高于KrouseⅠ期患者(0.0%及16.7%)(P0.05);HPV+ NSIP患者组织pAkt及pS6阳性率(分别为74.5%及80.9%)显著高于HPV-NSIP患者(分别为51.6%及58.1%)及对照组(分别为26.3%及21.1%)(P0.05)。2.PI3K/Akt/mTOR信号通路在HPV感染细胞中的作用及机制研究HPV11 E6/E7质粒转染的NP69-SV40T及CNE1细胞的增殖活性显著高于对照组细胞,且呈现明显的时间依赖性(提高1.25-1.62倍,P0.01),mTOR抑制剂雷帕霉素能有效逆转HPVl1 E6/E7诱导的细胞增殖活性的升高;HPV11 E6/E7质粒转染显著抑制细胞凋亡,且呈现时间依赖性(约降低17%-25.1%,P0.05);HPV E6/E7质粒转染对PI3K、Akt、mTOR、S6、MAPK及p21转录水平及蛋白表达水平无明显影响(P0.05);但能显著促进p-PI3K(1.47/1.54倍)、pAkt(1.3/2.42倍)、pmTOR(1.6/2.2倍)、pS6(1.6/1.7倍)及pMAPK(2.47/2.53倍)蛋白的表达;此外,HPV11 E6/E7质粒转染显著抑制p53(37.9%/59.3%)及Caspase-3(54.3%/61.2%)转录及蛋白的表达,而上调Cyclin D1的表达(1.85/2.28倍)。主要结论1.NSIP患者HPV感染率58.8%,11型是HPV感染相关的NSIP最主要的病毒亚型,高危型HPV感染的NSIP发生不典型增生、恶性转化及临床分期较高,HPV感染及其亚型与NSIP发生、发展及恶性转化型密切相关。2.HPV11 E6/E7质粒转染鼻咽部上皮细胞及鼻咽癌细胞能激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进MAPK信号的激活,进而抑制p53及Caspase-3的表达,促进Cyclin D1表达上调,从而抑制细胞凋亡并促进细胞增殖。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.62
【图文】：

百分比,多重感染,患者,检出

注：３与Ｋｒｏｕｓｅ邋ＩＩ期患者比较；１５与Ｋｒｏｕｓｅ邋ＩＩＩ期患者比较；ｅ与Ｋｒｏｕｓｅ邋ＩＶ期患者比较。逡逑２．２．５邋ＨＰＶ亚型分析逡逑采用导流杂交对４７例ＨＰＶ感染阳性样本进行基因分型，结果显示（图１），共逡逑检出１２型ＨＰＶ病毒，包括６例多重感染。其基因分布为：ＨＰＶ６邋（５／５３，邋９．４％）、逡逑ＨＰＶ１１邋（２０／５３，邋３７．７％）、ＨＰＶ１６邋（７／５３，邋１３．２％）、ＨＰＶ１８邋（４／５３，７．５％）、ＨＰＶ３３邋（２／５３，逡逑３．８％）、ＨＰＶ４４邋（２／５３，邋３．８％）、ＨＰＶ５２邋（５／５３，邋９．４％）、ＨＰＶ５３邋（１／５３，邋１．９％）、ＨＰＶ５６逡逑（１／５３，１．９％）、ＨＰＶ５７邋（２／５３，邋３．８％）、ＨＰＶ５８邋（３／５３，邋５．７％）、ＨＰＶ６８邋（１／５３，邋１．９％）。逡逑ＨＰＶ１１是检出最多的基因型（３７．７％），其次为ＨＰＶ１６（１３．２）。其中低危型ＨＰＶ（６、逡逑１１、４４）共邋２７邋例（５０．９％），高危型邋ＨＰＶ邋（１６、１８、３３、５２、５６、５７、５８、６８）共逡逑２５例（４７．２％）。６例多重感染均为二重感染，其中高低危混合型感染５例（１６／１１、逡逑１６／１１、１６／６、１８／１１、５８／１１）

鼻腔鼻窦,免疫组化分析,患者,上皮

数染色细胞进行定性及半定量分析。逡逑（１）邋ｐＡｋｔ在ＮＳＩＰ组织中的表达情况逡逑各组患者代表性鼻腔、鼻窦粘膜表层上皮组织病理及免疫组化染色见图２，与逡逑对照组比较，ＮＳＩＰ患者表皮组织呈现高度增生，并深入至皮下间质，伴随不同程度逡逑的组织分化，细胞出现异质性。免疫组化染色显示，ｐＡｋｔ表达阳性细胞的胞浆及胞逡逑膜通过抗原抗体反应而呈现棕色，ＮＳＩＰ患者组织ｐＡｋｔ阳性细胞数显著高于对照组，逡逑ＨＰＶ＋邋ＮＳＩＰ患者ｐＡｋｔ染色强度显著高于ＨＰＶ＿邋ＮＳＩＰ及对照组。逡逑ｉｋ邋１１逡逑＇■＾ｂ－逦．１：＇震；ｉ邋？？、私－今逡逑■邋Ｖ逦Ｖ逡逑｜逡逑＜逡逑0■逡逑？邋．邋＇逡逑－；ｒ邋￣逦＇逦．．．逦＇邋ｉ，逦■邋ｕ邋＇ｎ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＨＰＶ－邋ＮＳＩＰ逦ＨＰＶ＋邋ＮＳＩＰ逡逑图２邋Ｈ＆Ｅ染色及免疫组化分析ｐＡｋｔ在对照组、ＨＰＶ－邋ＮＳＩＰ及ＨＰＶ＋邋ＮＳＩＰ组患者鼻腔鼻窦上皮逡逑组织中的表达情况。逡逑表８统计了各组患者鼻腔、鼻窦上皮组织ｐＡｋｔ阳性率，ＮＳＩＰ患者鼻腔、鼻窦逡逑上皮组织中ｐＡｋｔ表达阳性率（ＨＰＶ－及ＨＰＶ＋ＮＳＩＰ分别为１６／３１，邋５１．６％及３５／４７，邋７４．５％邋）逡逑均显著高于对照组（１０／３８，２６．３％）邋（Ｐ＜０．０５），提示ｐＡｋｔ在ＮＳＩＰ组织中表达上调。逡逑此外

鼻腔鼻窦,免疫组化分析,患者,上皮

逡逑（２）邋ｐＳ６在ＮＳＩＰ组织中的表达情况逡逑图３显示了各组患者鼻腔鼻窦上皮组织病理及ｐＳ６表达情况，ｐＳ６表达阳性细胞逡逑通过抗原抗体反应而呈现棕黄色，ＨＰＶ＋ＮＳＥＰ患者ＰＳ６染色强度及阳性细胞数显著逡逑２６逡逑

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