飞秒激光脉冲技术辅助构建组织工程兔角膜内皮植片的可行性研究

发布时间：2020-09-12 13:05

　　目的:以飞秒激光脉冲技术辅助制备的超薄脱细胞猪角膜基质片(Femtosecond laser-Acellular Porcine Cornea Matrix,FS-APCM)为支架,收集人脐带血间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)调节培养基促进兔角膜内皮细胞的体外增殖为种子细胞,体外模拟构建组织工程生物兔角膜内皮层植片,从而探讨组织工程角膜内皮层构建的可行性研究。方法:将成年新西兰大白兔完整的角膜在无菌条件下取出后将带有内皮细胞的后弹力层面完整分离,体外消化、纯化后得到兔角膜内皮细胞(Rabbit corneal endothelial cell,RCECs)后进行培养。选用P3-P7代HUMSCs,以5×10~5/cm2接种传代、重悬,分别加入10%、30%、50%、70%、100%不同浓度HUMSCs调节培养基(human umbilical mesenchymal stem cells condition medium,HUMSCs-CM)培养,观察不同浓度HUMSCs-CM对RCECs细胞增殖能力影响。通过传统手工剖切技术和飞秒激光脉冲技术对比以寻找和优化支架条件,利用飞秒激光脉冲技术获得带有后弹力层的超薄猪角膜基质支架(厚度约100μm、直径约8.5mm),于0.5%SDS溶液中4℃脱细胞24 h后,获取FS-APCM。选用70%浓度HUMSCs-CM培养下RCECs的进行Dil荧光标记追踪,悬架培养法将RCECs细胞悬液小心滴加在经过预处理的于FS-APCM支架上,倒置显微镜下分别在接种后2h,3d,5d,1w分别观察体外重建后内皮细胞形态变化。结果:1.体外RCECs原代培养活性良好。RCECs在体外生长状态良好,6天可基本长满皿底形成紧密单层,细胞大小均一,形态基本一致,多为近似鹅卵石内皮样形态。2.70%HUMSCs-CM能够有效促进RCECs体外增殖。RCECs形态学及MTT法显示,在同一作用时间(24h)、不同浓度梯度(10%CEC-CM、30%HUMSCs-CM、50%HUMSCs-CM、70%HUMSCs-CM、100%HUMSCs-CM)作用下均能促进RCECs增殖,其中70%HUMSCs-CM作用最为显著,P1至P4代具有一致性结果。平板克隆实验结果显示,70%HUMSCs-CM能有效促进RCECs细胞体外增殖。3.与传统手工剖切支架方式相比,飞秒激光脉冲技术辅助下超薄脱细胞猪角膜支架(厚度约100μm、直径约8.5mm)具有较好的重复性和可操作性。组织学检测发现传统手工环钻剖切猪角膜组(T-PC组)角膜厚度最厚,飞秒激光脉冲技术剖切猪角膜支架组(FS-PC)组织切片十分微薄,类似于一薄片。含水量检测结果显示NPC组溶胀后含水量最高,T-PC次之,FS-PC组含水量最低。HE染色、DAPI染色及DNA含量检测均显示0.5%SDS脱细胞猪角膜基质脱细胞彻底无细胞残留。4.体外模拟构建人工生物角膜内皮植片证实内皮细胞存活状态良好。将RCECs种子细胞接种于FS-APCM支架后悬架培养1w,茜素红染色、Dil荧光追踪观察显示,RCECs可在FS-APCM上均可形成连续的单细胞层,胞间连接紧密,细胞计数密度大于2000cells/mm~2。结论:1.70%人脐带血间充质干细胞调节培养基(HUMSCs-CM)能有效刺激兔角膜内皮细胞体外增殖,为今后角膜内皮细胞体外培养提供一种简单、高效的方法;2.飞秒激光脉冲技术辅助制备的超薄脱细胞猪角膜基质支架(FS-APCM)能对角膜基质进行精准切割,为组织工程支架材料优化提供更佳的选择。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R779.6
【部分图文】：

原代培养,后弹力层,角膜缘,细胞连接

图 2-1 兔角膜内皮细胞原代培养。A.显微镜下可见环形剪下角膜缘 B.完整分离出后弹力层 C.撕除的兔角膜后弹力层自然向内卷曲 D.细胞 2h 开始贴壁 E.2day 见贴壁的细胞呈触角状F.6day 可见细胞连接紧密，具有典型的鹅卵石样形态(40X)。

标志物,培养的,后弹力层,间充质干细胞

第 2 章人脐带血间充质干细胞调节培养基促进兔角膜内皮细胞体外增殖图 2-1 兔角膜内皮细胞原代培养。A.显微镜下可见环形剪下角膜缘 B.完整分离出后弹力层 C.撕除的兔角膜后弹力层自然向内卷曲 D.细胞 2h 开始贴壁 E.2day 见贴壁的细胞呈触角状F.6day 可见细胞连接紧密，具有典型的鹅卵石样形态(40X)。

内皮,标志物,梯度

2-3 琼脂糖凝胶电泳检测 RCECs 表达内皮标志物 ZO-1、Na+/k+-ATPaseN-caderin、Vimentin、AQP1、CollagenIIIa。不同浓度梯度调节培养基（HUMSCs-CM）对 RCECs 体外响了确定不同浓度梯度的 HUMSCs-CM 是否能够增强 RCECs 的增殖中使用不同浓度梯度的 HUMSCs-CM 体外培养 RCEC 后进行 MTT隆形成实验，结果显示 HUMSCs-CM 能够显著增强 RCECs 体外增胞形态、生长活性都有促进作用。同时我们观察发现，70%HUMS效果最明显。为进一步证实结论，我们通过 HUMSCs-CM 作用于ECs(P1-P4)均得出一致性结论。

【参考文献】