CDCA2在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响

发布时间：2020-10-18 16:00

　　 目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种起源于鼻咽部粘膜的恶性肿瘤。其起病隐蔽、恶性程度高、易发生转移,严重威胁患者的身心健康。大量研究发现癌基因的过度表达是鼻咽癌发生、发展的重要生物因素。近年来,研究发现细胞分裂周期相关蛋白2(Cell Devision Cycle Associated 2,CDCA2)在多种肿瘤中表达上调,且其表达上调与肿瘤的发生、发展及预后有关,但在鼻咽癌中尚未见有报道。本研究主要探讨CDCA2在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。方法:1.应用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry)技术检测鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织中CDCA2 mRNA和蛋白质的表达水平,分析CDCA2表达与鼻咽癌临床病理特征的关系。2.应用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测鼻咽癌细胞株HK1、HONE1、5-8F、CNE1、CNE2和CNE2Z细胞中CDCA2蛋白的表达,确定用于后续研究的细胞株。3.利用慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,敲低HK1、HONE1和5-8F细胞株中的CDCA2表达。将载有CDCA2沉默片段的慢病毒分别转染鼻咽癌细胞株HK1,HONE1和5-8F,建立实验组(HK1-shCDCA2,HONE1-shCDCA2,5-8F-shCDCA2)。转染载有空载片段的慢病毒的细胞作为阴性空载组(HK1-shCtrl,HONE1-shCtrl,5-8F-shCtrl),未作处理的细胞为空白对照组(HK1,HONE1,5-8F)。用荧光显微镜观察慢病毒感染效率,用qRT-PCR和WB法分别检测各组细胞CDCA2 mRNA和蛋白的表达情况,以确定沉默效果。4.采用CCK-8实验和细胞平板克隆形成实验来评价沉默CDCA2对HK1、HONE1和5-8F细胞增殖能力的影响。5.应用细胞划痕实验、Transwell迁移和Transwell侵袭实验来检测CDCA2表达抑制对HK1、HONE1和5-8F细胞迁移及侵袭能力的影响。6.用流式细胞技术检测各组细胞的细胞周期和凋亡情况。7.用WB检测CDCA2是否影响细胞周期相关蛋白的表达。结果:1.16例鼻咽癌组织和16例鼻咽部粘膜慢性炎组织中CDCA2mRNA的相对表达量分别为5.319±3.198,1.148±0.759。相对于鼻咽部粘膜慢性炎组织,鼻咽癌组织中CDCA2 mRNA的相对表达量明显增高,差别具有统计学意义(P0.001)。CDCA2蛋白在鼻咽癌组织中表达的阳性率为60.47%(52/86),明显高于其在鼻咽部粘膜慢性炎组织中表达的阳性率11.76%(6/51),且其表达与肿瘤局部浸润(P=0.033)、淋巴结转移(P=0.034)有关。2.与CNE1、CNE2和CNE2Z相比,HK1、HONE1及5-8F中CDCA2的基础表达相对较高,因此本研究选择此3株细胞用于后续的体外细胞实验。3.实验组和阴性空载组的慢病毒转染效率均大于90%;与阴性空载组和空白对照组相比,CDCA2 mRNA和蛋白在实验组的表达均明显降低(P0.001),说明成功构建了CDCA2沉默鼻咽癌细胞稳定株。4.CCK-8实验显示,敲低CDCA2表达后,HK1、HONE1以及5-8F细胞48h后的增殖能力显著降低(P0.05)。平板克隆形成实验中,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的克隆形成率分别为(63.733±3.859)%、(63.467±4.601)%和(41.133±2.344)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的克隆形成率分别为(44.200±3.143)%、(45.667±2.516)%和(35.200±2.553)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的克隆形成率分别为(64.667±3.113)%、(65.667±2.516)%和(53.267±2.610)%。据此,CDCA2沉默表达后,鼻咽癌细胞克隆形成能力显著降低(P0.05)。5.沉默CDCA2表达后,未发现鼻咽癌细胞株HK1、HONE1及5-8F细胞的迁移侵袭能力发生显著变化(P0.05)。6.用流式细胞仪检测细胞周期,实验结果显示HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(62.380±2.868)%、(62.723±1.806)%和(69.507±2.607)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(33.697±1.825)%、(32.603±2.365)%和(45.320±1.360)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(62.050±3.080)%、(62.810±2.440)%和(68.373±2.437)%。实验组较阴性空载组和空白对照组G0+G1期的细胞数明显上升,差异有统计学意义(P0.05),而3株细胞在G2+M期以及S期的变化表现不一。用Annexin V-APC/7-AAD双染料法检测细胞凋亡率,实验结果显示敲低CDCA2后,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的总凋亡率分别为(7.303±0.702)%、(7.170±0.310)%和(8.967±0.656)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的总凋亡率分别为(7.040±0.616)%、(6.907±0.708)%和(16.397±1.903)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的总凋亡率分别为(18.570±1.415)%、(17.883±1.734)%和(23.343±2.270)%。鼻咽癌细胞总凋亡率升高,差别有统计意义(P0.05)。7.WB显示,CDCA2沉默后,细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和细胞周期蛋白依赖性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)的表达显著降低,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21蛋白表达显著增高;细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达无明显变化。结论:1.较鼻咽部粘膜慢性炎组织,CDCA2 mRNA和蛋白在鼻咽癌组织中的表达上调,且其表达上调可能与肿瘤局部浸润及淋巴结转移有关。2.CDCA2可能通过影响鼻咽癌细胞中细胞周期蛋白CDK4、CDK6和p21的表达来调控细胞周期,促进鼻咽癌细胞增殖,同时可能影响细胞凋亡。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.63
【部分图文】：

图 1-1. Real-Time PCR 反应条件Figure 1-1. Real-Time PCR protpcol2.3.2 Real-time PCR 扩增产物特异性的判断对 Real-time PCR 扩增产物的熔解曲线进行分析，确定 β-actin 引物和CDCA2 引物是否具有特异性以及 PCR 产物是否单一。若熔解曲线呈特异性单一溶解峰且曲线光滑，则说明产物特异且单一，未出现非特异性扩增。若出现多个溶解峰或主峰异常增宽，则提示实验可能存在引物二聚体，或存在非特异性扩增等其它非目的性产物。2.3.3 CDCA2 基因 mRNA 表达水平的定量分析方法本研究选择 β-actin 作为内参基因，通过记录实验组样本和对照组样本的内参及目的基因 Ct 值，根据内参的 Ct 值对目的基因进行差值校正，最

2 mRNA 在鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织中的qRT-PCR方法检测 16 例鼻咽癌组织和 16 例鼻咽部粘A2 mRNA 的相对表达量。用试验方法部分 2.3.3 所CDCA2 mRNA的相对表达量，结果显示：CDCA2 m鼻咽部粘膜慢性炎组织中的相对表达量分别为 559。鼻咽癌组织中 CDCA2 mRNA 的相对表达量明显组织，P值小于 0.001，差别具有统计学意义（表 3 3-1. CDCA2 mRNA 在鼻咽部粘膜慢性炎组织和鼻咽癌组织中的相对表组别 例数(n) 2-ΔΔCt( ±s) P粘膜慢性炎组织(N) 16 1.148±0.759<0组织(NPC) 16 5.319±3.198

硕士研究生学位论文 CDCA2 在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响1.2 CDCA2 蛋白在鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织中的表达为了比较和研究 CDCA2 蛋白在鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织之间的表达情况，本研究采用免疫组织化学方法对 86 例鼻咽癌患者及 51例鼻咽部粘膜慢性炎患者的组织蜡块切片进行染色。免疫组织化学染色显示，鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织中 CDCA2 蛋白呈淡黄色或棕黄色，主要分布于细胞核上（图 1-3）。CDCA2 蛋白在鼻咽癌组织中表达的阳性率为60.47%(52/86)，明显高于其在鼻咽部粘膜慢性炎组织中表达的阳性率 11.76% (6/51)，且 P值小于 0.001，差别具有统计学意义（表 3-2）。
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本文编号：2846512