Neuritin重组腺相关病毒2修复大鼠受损视神经的作用及机制

发布时间：2017-08-06 22:23

  本文关键词：Neuritin重组腺相关病毒2修复大鼠受损视神经的作用及机制

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【摘要】：目的:视神经作为中枢神经系统的一部分,由于其特殊的解剖生理特性成为研究中枢神经损伤和再生的理想部位。研究视神经损伤后的再生,不仅对视神经损伤的治疗,同时也对中枢神经系统疾病和损伤后的治疗及功能恢复有着重要的意义。临床上治疗视神经损伤的方法主要有药物治疗、视神经管减压手术、电针和针灸等,但受损神经难以再生。视神经损伤后会引起视网膜节细胞(RGCs)的逐渐凋亡、内在再生能力低下及轴突的再生抑制性微环境等问题。目前促进受损视神经再生的方法主要有:周围神经移植、细胞移植、添加神经营养因子和基因治疗等;找准靶分子,应用基因治疗视神经损伤是近年来研究的热点,极富应用前景。重组腺相关病毒2(AAV2)是用于眼部最安全、合适的载体,且研究发现神经突起素(Neuritin,Nrn1)具有独特的神经营养作用。本课题采用大鼠的视神经压榨伤模型,以Nrn1为靶分子,研究Nrn1对视神经损伤后RGCs存活和轴突再生的作用及机制。方法:(1)构建Neuritin重组腺相关病毒2质粒并包装测定其滴度。(2)玻璃体注射及视神经压榨伤模型制作:用微量注射器吸取按照每只眼球2μl的rAAV2-EGFP、rAAV2-Nrn1-EGFP或者生理盐水注射到大鼠的玻璃体腔,4周后用Yasargil动脉瘤夹在大鼠视神经眼球后2mm处夹伤9s,2周后经心脏灌注取材。(3)采用免疫荧光组织化学检测rAAV2在视网膜中转染细胞的类型以及转染RGCs的效率。(4)采用Real-timePCR和Westernblot检测Nrn1在各组视网膜中mRNA和蛋白的表达变化。(5)采用HE染色、免疫组织化学、CTB追踪和TUNEL检测视神经损伤后视网膜Nrn1过表达对RGCs存活、凋亡的作用。(6)采用RITC标记和透射电镜检测视神经损伤后视网膜Nrn1过表达对视神经轴突再生的作用。(7)采用瞳孔对光反射和闪光视觉诱发电位检测视神经损伤后视网膜Nrn1过表达对视觉功能恢复的作用。(8)采用Westernblot检测视神经损伤后视网膜Nrn1过表达对细胞内信号转导通路关键分子pAkt1、pAkt2、pErk1/2和pStat3表达的作用,同时检测对细胞凋亡相关分子Bcl-2和Bax、Caspase3和CleavedCaspase3表达的作用。结果:(1)成功构建Neuritin重组腺相关病毒2的质粒,测得的rAAV2-EGFP病毒滴度为2.24×1012vg/ml,rAAV2-Nrn1-EGFP病毒滴度为2.34×1012vg/ml。(2)成功注射Neuritin重组腺相关病毒2,4周后视网膜铺片结果显示视网膜大部分细胞和神经纤维表达绿色荧光;免疫荧光组织化学结果显示rAAV2-EGFP转染约70%的RGCs,且几乎不转染RGCs层的星形胶质细胞。(3)成功在视网膜内过表达Nrn1,Real-timePCR和Westernblot结果显示rAAV2-Nrn1-EGFP组中Nrn1mRNA和蛋白含量分别约为rAAV2-EGFP组的19倍和2.3倍;ONC/rAAV2-Nrn1-EGFP组Nrn1mRNA和蛋白含量分别约为ONC/rAAV2-EGFP组的6倍和2倍。(4)视网膜Nrn1过表达对RGCs存活、视神经轴突再生和视觉功能恢复的作用:HE染色结果显示RGCs层细胞存活数量增多,gammasynuclein免疫组织化学和CTB追踪结果显示RGCs的存活数量增加,TUNEL检测结果显示RGCs层的细胞凋亡数量明显减少;RITC标记视神经结果显示存留和再生的轴突显著增加,透射电镜结果显示大部分轴突的髓鞘板层保持紧致,少许稍有松散和变宽;瞳孔对光反射结果显示瞳孔从最大缩小至最小时直径的比值明显减小,闪光视觉诱发电位结果显示P波的潜伏期时间缩短、振幅增强。(5)视网膜Nrn1过表达对细胞内信号转导通路关键分子表达的作用:Westernblot结果显示同时上调pAkt1和pStat3表达,而对pAkt2和pErk1/2均无明显作用。视网膜Nrn1过表达对细胞存活相关分子表达的作用:Westernblot结果显示视网膜中Bcl-2表达上调、Bax表达下调,Caspase3和CleavedCaspase3表达下调。结论:(1)玻璃体注射rAAV2-EGFP后,主要转染视网膜中约70%的RGCs,几乎不转染RGCs层的星形胶质细胞。(2)玻璃体注射rAAV2-Nrn1-EGFP后,Nrn1在视网膜内过表达。(3)视神经损伤后视网膜中过表达Nrn1,可激活Akt1和Stat3通路,进而抑制线粒体凋亡通路,保护RGCs存活、促进视神经轴突再生及视觉功能恢复。
【关键词】：neuritin 视神经 损伤 基因治疗 视网膜节细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.6
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-13
• 前言13-16
• 一、视神经损伤及治疗13
• 二、视神经损伤的基因治疗13-16
• 实验材料及方法16-33
• 一、实验材料16-18
• （一）重组腺相关病毒2载体、细胞株和菌株16
• （二）实验动物16
• （三）主要试剂16-17
• （四）主要设备17-18
• （五）主要溶液的配置18
• 二、实验方法18-33
• （一）Neuritin重组腺相关病毒2的构建18-24
• （二）大鼠玻璃体腔注射24
• （三）动物实验的分组及实验流程24
• （四）大鼠视神经压榨伤模型的制作24-25
• （五）玻璃体注射FITC-CTB及RITC25
• （六）动物标本的固定取材25
• （七）视网膜铺片及RGCs计数25
• （八）眼球的石蜡切片25-26
• （九）眼球及视神经的冷冻切片26
• （十）免疫荧光组织化学26
• （十一）实时荧光定量PCR26-28
• （十二）免疫印迹法（Western blot）28-29
• （十三）伊红-苏木素（HE）染色29-30
• （十四）免疫组织化学30
• （十五）细胞凋亡（TUNEL）检测30-31
• （十六）透射电子显微镜观察31
• （十七）瞳孔对光反射31
• （十八）闪光视觉诱发电位31-32
• （十九）统计学方法分析32-33
• 实验结果33-61
• 一、成功构建Neuritin重组腺相关病毒2质粒33-34
• 二、Neuritin重组腺相关病毒2的包装34-36
• 三、Neuritin重组腺相关病毒2转染大鼠视网膜36-38
• 四、转染后Neuritin在视网膜中的过表达38-41
• 五、Neuritin过表达对受损视神经及其RGCs的作用41-54
• 六、Neuritin过表达对细胞内信号转导通路关键分子表达的作用54-58
• 七、Neuritin过表达对细胞存活相关分子表达的作用58-61
• 讨论61-68
• 一、视神经损伤基因治疗中转染视网膜的病毒载体61-62
• 二、Neuritin对大鼠受损视神经的修复作用62-64
• （一）Neuritin在神经发育中的作用62-63
• （二）Neuritin在神经损伤中的表达变化及作用63
• （三）Neuritin保护受损视神经的RGCs63
• （四）Neuritin促进受损视神经再生63-64
• 三、Neuritin保护RGCs存活的作用机制64-66
• （一）Neuritin结合胰岛素受体发挥作用64
• （二）Neuritin激活Akt1、Stat3通路64-65
• （三）Neuritin抑制经线粒体细胞凋亡通路65-66
• 四、Neuritin促进视神经再生的作用机制66-68
• 附录68-71
• 参考文献71-76
• 全文小结76-77
• 创新点和意义77-78
• 在校期间发表的论文78-79
• 综述79-89
• 参考文献86-89
• 致谢89

【参考文献】

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1 Akintomide Apara;Jeffrey L.Goldberg;;Molecular mechanisms of the suppression of axon regeneration by KLF transcription factors[J];Neural Regeneration Research;2014年15期

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本文编号：631743