咖啡因对大鼠酒精性肝纤维化HSC中cAMP和PI信号通路作用研究

发布时间：2017-03-26 11:06

  本文关键词：咖啡因对大鼠酒精性肝纤维化HSC中cAMP和PI信号通路作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酒精性肝纤维化(Alcoholic liver fibrosis, ALF)是酒精性肝病(Alcoholic liverdisease, ALD)发展进程中的一种形式，ALD前期主要表现为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎等症状，之后发展成ALF甚至酒精性肝硬化，最终可导致肝细胞广泛性坏死，形成肝功能衰竭。ALF是长期酒精刺激下肝脏组织以细胞外基质(Extracellularmatrix, ECM)增生为特征的病症，是ALD发病的关键环节，有效治疗ALF可以阻断或延缓慢性ALD向酒精性肝硬化发展，但是目前尚未研究出防治ALF的理想药物。 咖啡因(caffeine)是日常饮料咖啡、茶叶中的主要成分。饮用含有caffeine的饮料已经遍及全球，在传统观念里，，饮用太多含caffeine的饮料似乎对健康无益，但近年来多项研究报道饮用以caffeine为基础的饮料能够降低患肝脏疾病的概率，尤其对长期饮酒者更加明显。本课题组前期研究表明caffeine对ALF大鼠具有一定的防治作用，然而caffeine发挥作用的机制还没有完全阐明，本实验在参考国内外相关文献的基础上，采用酒精浓度逐渐递增法，每日2次灌胃，连续12w，建立ALF大鼠模型，采用Collagenase IV原位灌流法分离原代HSC(Hepatic stellate cell,HSC)，观察caffeine对HSC中cAMP信号通路的作用，此外，采用乙醛刺激大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell-T6, HSC-T6)建立ALF体外模型，观察caffeine对乙醛诱导的HSC-T6中PI信号通路的作用。主要研究内容如下： 1.Caffeine对ALF大鼠HSC中cAMP-PKA-CREB信号通路的作用 采用酒精每天2次灌胃，连续12周，制备大鼠ALF模型，将大鼠随机分为正常组、模型组、caffeine(5,10,20mg/kg)、阳性对照药秋水仙碱组(0.1mg/kg)，在常规造模的同时按相应药物给药剂量灌胃给药；12周末处死大鼠，Collagenase IV原位肝灌注法分离大鼠HSC，在荧光显微镜下观察HSC自发荧光；台盼蓝拒染实验观察各组HSC数量和活性；免疫细胞化学检测α-SMA表达；流式细胞仪(FCM)检测细胞周期，~(125)I-cAMP放射免疫分析方法测定各组大鼠HSC中cAMP含量；RT-PCR法测定I型胶原, III型胶原, α-SMA, PKA, CREB mRNA表达情况。结果显示，ALF模型大鼠HSC在荧光显微镜下自发蓝绿色荧光；与正常组相比，模型组HSC数量和活性明显增加；S期细胞及G2/M期细胞显著增多； cAMP含量明显增加；I型胶原, III型胶原，α-SMA,PKA, CREB大量表达；与模型组相比，caffeine(10,20mg/kg)组可明显阻滞细胞周期于G2/M期；并显著降低I型胶原, III型胶原,α-SMA, PKA, CREB表达。以上结果表明，caffeine对ALF大鼠HSC增殖和活化有一定抑制作用，其机制可能与其抑制HSC中cAMP-PKA-CREB信号通路有关。 2.Caffeine对乙醛刺激的HSC-T6中PLC-DAG-PK C信号通路的作用 采用不同浓度乙醛不同时间间隔干预HSC-T6，建立大鼠ALF的体外HSC模型：采用MTT法检测HSC-T6增殖，确定造模浓度及时间；RT-PCR法检测α-SMAmRNA表达，明确HSC-T6活化情况；乙醛在caffeine加入大鼠HSC-T61h后加入，分别于24h,48h,72h用四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-2,5-,MTT]法检测HSC-T6增殖情况；采用RT-PCR法检测HSC-T6中PLC mRNA表达；液体闪烁仪检测DAG含量；细胞PKC激酶活性光谱法定量试剂盒检测胞内PKC活性。结果显示，200μmol/L乙醛作为ALF体外HSC造模浓度较理想，与对照组相比，模型组HSC-T6明显增殖活化，PLC表达及DAG含量明显增加。PKC活性明显增强；与模型组相比，caffeine对乙醛刺激的HSC-T6增殖具有抑制作用，且表现出一定的浓度和时间依赖性，24,48,72h的半效抑制浓度(50%inhibitingconcentration, IC50)分别为22.512,4.553,2.021mmol/L；caffeine(2,4mmol/L)能明显下调胞内PLC的表达，减少DAG含量，抑制PKC活性；以上结果表明，caffeine能抑制乙醛刺激的大鼠HSC-T6的增殖，其机制可能与caffeine抑制胞内PLC-DAG-PKC信号通路有关。本实验为caffeine应用于临床治疗ALF提供了一定的体外实验基础，为评价、筛选有效治疗ALF的药物提供了新思路。
【关键词】：咖啡因 酒精性肝纤维化 肝星状细胞 环磷腺苷酸 磷脂酰肌醇
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 英文缩略词5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 1 前言13-15
• 2 实验材料15-21
• 3 实验方法21-31
• 4 实验结果31-45
• 5 讨论45-49
• 6 结论49-51
• 参考文献51-55
• 个人简历55-56
• 致谢56-57
• 综述57-70
• 参考文献67-70

【参考文献】

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  本文关键词：咖啡因对大鼠酒精性肝纤维化HSC中cAMP和PI信号通路作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：268696