AT4R过表达抑制动脉粥样硬化的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-13 18:25

  本文关键词：AT4R过表达抑制动脉粥样硬化的作用及其机制研究

  更多相关文章： AT4R 动脉粥样硬化 早期斑块形成 晚期斑块稳定性

【摘要】：研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病是一类非常重要的心血管疾病。实验证实动脉粥样硬化(AS)斑块形成可导致管腔狭窄引发缺血,而斑块破裂及血栓形成则可导致急性心脑血管事件的发生。因此,对于AS早期斑块形成和晚期斑块稳定性的研究一直是国内外冠状动脉粥样硬化性心脏病研究的热点问题。肾素一血管紧张素系统(RAS)在心血管系统疾病的病理生理中发挥着至关重要的作用。血管紧张素IV型受体(AT4R)是RAS系统中的一员,是一种II型膜蛋白并且属于锌金属肽酶M1家族。同时AT4R被认为是一种胰岛素调节的氨基肽酶(IRAP)并可以通过结合血管紧张素IV (AngⅣ)发挥作用。在心内膜、心外膜、血管平滑肌细胞、心肌成纤维细胞、冠状动脉和主动脉内皮细胞等心血管的组织和细胞中都有AT4R的存在。既往研究发现AT4R可以诱导激活肺内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性并且参与调节肺动脉的舒张。AT4R还可协同成纤维细胞生长因子(bFGF)参与血管重建。此外,研究还发现AT4R和Ang Ⅳ共同作用可以改善AngⅡ刺激以及缺血再灌注引起的心功能紊乱和损伤。在晚期AS模型中, Ang Ⅳ通过结合AT4R能够改善内皮功能,增加eNOS活性及降低超氧化物的产生,进而发挥血管保护作用。这些实验结果提示Ang Ⅳ可通过结合AT4R,在心血管系统疾病中起着保护作用,然而AT4R其本身在AS中发挥何种作用及其可能的作用机制尚未见报道,这为我们提供了课题思路和实验设计方向。研究目的1.探讨AT4R过表达对AS早期斑块形成的影响；2.探讨AT4R过表达对AS晚期斑块稳定性的影响；3.阐明AT4R过表达抗AS作用可能的机制。实验方法1.构建ApoE-/-小鼠AS动物模型(1)早期组：8周龄雄性ApoE-/-小鼠普通饮食适应性喂养3天后给予高脂饮食(0.25%的胆固醇和15%的黄油)8周。高脂饮食至第4周将小鼠随机分为Ad-AT4R组,Ad-EGFP组和Control组,每组20只。Ad-AT4R组和Ad-EGFP组分别通过尾静脉注射携带有AT4R的腺病毒、空病毒载体,病毒滴度为2×109PFU,体积为200μL。 Control组同时注射等量的PBS溶液。2周后重复注射一次。继续高脂饮食至第8周处死小鼠。(2)晚期组：8周龄雄性ApoE-/-小鼠全程高脂饮食14周。高脂饮食至第2周行右颈总动脉套管植入术,套管长度为2mm,内径为0.3mm,外径为0.5mmm。第10周行颈动脉超声检查斑块形成情况并将小鼠随机分为三组：Ad-AT4R组，，Ad-EGFP组和Control组,每组20只,分别通过尾静脉注射携带有AT4R的腺病毒、空病毒载体及等量的PBS溶液。病毒滴度为2×109PFU,体积为200μL。2周后重复注射一次。继续高脂饮食至第14周处死小鼠。2.体重及血糖、血脂的检测小鼠处死前禁食,称量体重并于左心室穿刺取血,收集血清,检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖(GLU)。3.早期斑块面积的检测取早期组小鼠的主动脉根部包埋成石蜡标本并常规5μm切片,HE染色。另取主动脉根部冲洗,OCT包埋,常规5μm冰冻切片,油红o染色,同时行主动脉大体油红o染色。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算阳性染色面积占相应主动脉管腔的面积百分比。4.晚期斑块的检测(1)易损指数：OCT包埋晚期组小鼠的右颈总动脉,常规5μm冰冻切片并行油红O染色、HE染色及天狼猩红染色。免疫组化检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)以及平滑肌细胞(SMC)的含量。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算阳性染色面积占AS斑块面积的百分比。易损指数根据以下公式计算：易损指数=(巨噬细胞百分含量+脂质百分含量)／(平滑肌细胞百分含量+胶原百分含量)。(2)免疫组化：采用免疫组化的方法检测斑块内促炎性因子IL-6、TNF-a及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算阳性染色面积占AS斑块面积的百分比。(3) Western Blot:提取晚期组小鼠右颈总动脉的组织蛋白,并用Western Blot的方法检测促炎性因子IL-6、TNF-a,基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9以及RAS系统其他组分比如AT1R、 T2R、MasR、ACE、ACE2的蛋白表达水平。使用ImageJ软件分析蛋白表达含量。(4)明胶酶谱：提取晚期组小鼠右颈总动脉的组织蛋白,采用明胶酶谱的方法检测MMP-2及MMP-9的活性。使用Image J软件分析。5.统计学处理使用SPSS20.0统计软件分析。所得数据用均数±标准误(mean ±SEM)表示。组间差异采用单因素的方差分析(ANOVA). P0.05具有统计学意义。结果1.早期组1.1 AT4R过表达对ApoE-/-小鼠体重及血糖血脂的影响Ad-AT4R组、Ad-EGFP组和Control组三组之间小鼠的体重及血糖(GLU)、血脂指标(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之间未见显著性差异(P0.05)。1.2 AT4R转染效率的测定小鼠肝脏和主动脉根部斑块可见明显颗粒状黄绿色荧光,提示病毒成功转染至小鼠体内；Western Blot检测Ad-AT4R组小鼠主动脉组织蛋白表达,发现AT4R表达量明显高于Ad-EGFP组和Control组(P0.05),说明AT4R成功过表达。1.3 AT4R过表达对AS早期斑块的形成的影响与Ad-EGFP组及Control组对比,Ad-AT4R组小鼠主动脉根部AS斑块面积百分比明显降低(P0.05),而Ad-EGFP与Control组之间未见显著性差异(P0.05)。2.晚期组2.1 AT4R过表达对ApoE-/-小鼠体重及血糖血脂的影响Ad-AT4R组、Ad-EGFP组和Control组三组之间小鼠的体重及血糖(GLU)、血脂指标(TG、TC、HDL-C、LDL-C)之间未见显著性差异(P0.05)。2.2 AT4R转染效率的测定小鼠右颈动脉斑块内可见明显颗粒状黄绿色荧光,提示病毒成功转染至小鼠体内；Western Blot检测Ad-AT4R组小鼠主动脉组织蛋白表达,发现AT4R表达量明显高于Ad-EGFP组和Control组(P0.05),说明AT4R成功过表达。2.3 AT4R过表达对AS晚期斑块的稳定性的影响与Ad-EGFP组和Control组对比,Ad-AT4R组小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞及脂质百分含量降低(P0.05),平滑肌细胞和胶原含量增加(P0.05),斑块易损指数明显降低(P0.05),而Ad-EGFP组与Control组之间未见显著性差异(P0.05)。2.4AT4R过表达对晚期斑块内炎性因子IL-6、TNF-a的表达水平的影响与Ad-EGFP组及Control组对比,Ad-AT4R组小鼠颈动脉斑块内炎性因子IL-6、TNF-a蛋白表达下降(P0.05),Ad-EGFP组与Control组之间未见显著性差异(P0.05)。2.5 AT4R过表达对晚期斑块内基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性的影响与Ad-EGFP组及Control组对比,Ad-AT4R组小鼠颈动脉斑块内MMP-2、 MMP-9蛋白表达降低(P0.05),且MMP-2和MMP-9的活性降低(P0.05),Ad-EGFP组与Control组之间未见显著性差异(P0.05)。2.6 AT4R过表达对晚期斑块内RAS其他组分的影响与Ad-EGFP组及Control组对比,Ad-AT4R组小鼠颈动脉斑块内RAS其它组分(AT1R, AT2R, MasR, ACE and ACE2)蛋白表达未见显著性差异(P0.05)。结论1.AT4R过表达可通过降低斑块内脂质从而抑制动脉粥样硬化早期斑块的形成；2.AT4R过表达可减少晚期斑块内巨噬细胞和脂质含量,增加平滑肌细胞和胶原含量,从而降低斑块易损指数,增加斑块稳定性；3.AT4R过表达可降低斑块内IL-6、TNF-a的表达,从而减轻炎症、稳定斑块；4.AT4R过表达可降低MMP-2、MMP-9的表达及其活性,从而抑制ECM降解,稳定斑块；5.AT4R过表达对RAS系统其它成员(AT1R、AT2R、MasR、ACE、ACE2)的表达没有影响。
【关键词】：AT4R 动脉粥样硬化 早期斑块形成 晚期斑块稳定性
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 符号说明18-20
• 前言20-21
• 材料与方法21-35
• 结果35-37
• 讨论37-40
• 创新点与局限性40
• 结论40-41
• 附表41-42
• 附图42-52
• 参考文献52-57
• 致谢57-58
• 攻读学位期间发表的学术论文目录58-59
• 附件59

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本文编号：1026422