VEGF调控缝隙连接蛋白Cx43促进EPCs增殖，迁移及损伤血管修复的研究

发布时间：2017-10-15 22:31

  本文关键词：VEGF调控缝隙连接蛋白Cx43促进EPCs增殖，迁移及损伤血管修复的研究

  更多相关文章： 内皮祖细胞 血管内皮生长因子 缝隙连接蛋白43 增殖 迁移 血管损伤 再内皮化 内膜增生

【摘要】：1.背景和目的血管损伤性疾病是指各种原因引起血管结构或功能受损的疾病,发病率逐年升高,严重威胁人类健康。因此,如何促进损伤血管修复具有重大的科学研究价值和社会效益。内皮细胞排列在血管壁内层,在维持血管解剖和生理功能中发挥着重要的作用。各种病因可使内皮细胞受损,内皮完整性被破坏,最终导致动脉粥样硬化,是血管损伤性疾病的中心环节和始动因素。过去大家普遍认为血管损伤的修复主要依靠邻近成熟内皮细胞增殖并迁移至损伤区域。但成熟内皮细胞增殖能力较低,极大限制其在血管损伤修复中的作用。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)来源于骨髓或脾脏等组织,是一类可分化为内皮细胞的祖细胞。既往许多研究证实,当血管损伤时,机体动员EPCs至外周血,经血液循环归巢到血管损伤区域,增殖、分化为内皮细胞,参与血管损伤修复。血管内皮生长因子(vascular endothelial groth factor,VEGF)在生物体内广泛存在,有研究表明可体外增强EPCs分化、增殖等功能。而增加损伤血管局部VEGF表达,可促进EPCs归巢至靶区域,分化为内皮、抑制平滑肌增殖,是血管损伤修复中的关键因素之一,但其具体机制尚不完全清楚。缝隙连接蛋白(connexin,Cx)是构成细胞间缝隙连接(gap juncition,GJ)的基本单位。6个缝隙连接蛋白在细胞膜上构成中空的通道即连接子(connexon)。相邻细胞间的连接子吻合形成缝隙连接通道(gap junction channels,GJs),介导相邻细胞间能量、物质交换。在目前已经发现的20种缝隙连接蛋白中,Cx43在血管广泛分布,是维持血管正常功能的重要成分,与血管损伤性疾病疾病发生发展密切相关。进一步研究指出,Cx43可介导干祖细胞间形成缝隙连接。因此,本研究拟观察VEGF是否通过增强Cx43的表达,使缝隙连接功能增强,从而促进内皮祖细胞的增殖、迁移;此外,构建SD大鼠颈动脉损伤模型,探究Cx43是否参与VEGF介导的血管损伤修复。2.方法2.1 EPCs培养,鉴定从大鼠脾脏组织中分离、培养EPCs,分别于培养的第1天、第4天和第7天镜下观察细胞形态并拍照,使用FITC-UEA-I和Di I-ac-LDL双染对细胞进行鉴定。用流式细胞仪对细胞表面的EPCs标志性抗原(CD34,VEGFR-2)进行鉴定。2.2免疫荧光检测Cx43在EPCs中的表达和定位培养7天的EPCs,孵育Cx43一抗和荧光标记二抗,激光共聚焦显微镜下观察EPCs中Cx43的表达和定位。2.3 Western blot检测不同浓度VEGF调控EPCs中Cx43的表达及Cx43干扰si RNA转染效果培养7天的EPCs,分别给予0、10、50ng/m L VEGF刺激,进行western blot实验,观察Cx43表达的差异;分别用生理盐水、空载si RNA、Cx43干扰si RNA处理细胞,进行western blot实验,观察Cx43干扰si RNA的转染效果。2.4荧光漂白恢复(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)实验检测VEGF调控Cx43对相邻EPCs间缝隙连接功能的影响细胞实验分为3组:(1)对照组(2)VEGF组(3)VEGF+si Cx43组。培养7天的EPCs根据分组处理后利用FRAP实验检测各组相邻EPCs间缝隙连接功能,根据荧光恢复率评价缝隙连接功能;2.5观察VEGF调控Cx43对EPCs增殖、迁移的影响培养7天的EPCs同步化后,按照细胞实验分组处理后,CCK8检测EPCs增殖活性,Transwell检测EPCs迁移能力。2.6 VEGF调控Cx43参与血管损伤修复的在体研究2.6.1大鼠先行脾脏切除术,8天后再行颈动脉损伤。在大鼠颈动脉球囊损伤24小时后,将Dio-perchlorate标记的EPCs 2×10~6混悬在200μl PBS中从尾静脉注射。细胞移植前按照动物实验分组对细胞进行处理。为了观察EPCs的归巢情况,3天后处死大鼠,取出目标血管做冰冻切片进行荧光定位观察。2.6.2颈动脉损伤7天后各组随机选择三只大鼠,血管内注射evans blue,15min后处死大鼠,取出目标血管,观察再内皮化情况;颈动脉损伤14天后各组随机选择三只大鼠,处死后取出目标血管,HE染色观察内膜增生情况。3.结果3.1成功从大鼠脾脏分离出单个核细胞,经定向诱导培养后显微镜下见内皮系特征样生长,FITC-UEA-I和Di I-ac-LDL双染阳性,双染阳性率为92.00±2.23%(n=5),CD34和VEGFR-2在培养细胞中表达阳性率分别为89.67±1.39%(n=3)和92.07±1.35%(n=3),提示培养细胞为EPCs。3.2用激光共聚焦显微镜观察,可见细胞质和细胞膜上均有Cx43发出的绿色荧光。3.3 WB实验证实:10ng/m L组Cx43相对表达量显著高于0ng/m L组(1.42±0.47 vs1.00±0.31,p0.05)(n=5),且50ng/m L组Cx43相对表达量显著高于0ng/m L(2.07±0.49vs 1.00±0.31,P0.05)(n=5),50ng/m L组Cx43相对表达量显著高于10ng/m L组(2.07±0.49 vs 1.42±0.47,P0.05)(n=5);Cx43si RNA转染效率为62.95±7.71%(si Cx43组vs NS组,0.38±0.13 vs 1.00±0.14,p0.05)(n=3)。3.4荧光漂白恢复实验(FRAP)证实:荧光物质能够通过GJs在相邻EPCs间传递。各组相邻细胞荧光恢复率均显著高于孤立细胞(control组相邻细胞vs control组孤立细胞,25.85±4.00%vs 11.66±1.62%,p0.01),(VEGF组相邻细胞vs VEGF组孤立细胞,65.65±6.24%vs 14.23±1.77%,p0.01),(VEGF+si Cx43组相邻细胞vs VEGF+si Cx43组孤立细胞,31.31±1.53%vs 14.83±7.48%,p0.01)(n=6)。VEGF能促进EPCs间Cx43介导的缝隙连接(VEGF组vs control组,65.65±6.24%vs25.85±4.00%,p0.01)(n=6),抑制Cx43表达后,缝隙连接功能减弱(VEGF组vs VEGF+si Cx43组65.65±6.24%vs 31.31±1.53%,p0.01)(n=6)。3.5 VEGF调控Cx43对EPCs增殖、迁移功能的影响3.5.1 VEGF调控Cx43对EPCs增殖功能的影响使用光密度值(OD值)反映细胞增殖活性。CCK8分析提示:VEGF组EPCs增殖能力增强(VEGF组vs control组,1.73±0.07 vs 0.88±0.08,p0.01)(n=6),而抑制Cx43表达,EPCs增殖能力减弱(VEGF组vs VEGF+six43组,1.73±0.07 vs1.37±0.11,p0.01)(n=6)。3.5.2 VEGF调控Cx43对EPCs迁移功能的影响Transwell分析提示:VEGF组EPCs迁移数量增加(VEGF组vs control组,128.22±3.59个vs 84.14±4.58个,p0.01)(n=12),而抑制Cx43表达,EPCs迁移数量减少(VEGF组vs VEGF+si Cx43组,128.22±3.59个vs 104.00±3.92个,p0.05)(n=12)。3.6 VEGF调控Cx43参与血管损伤修复的在体研究3.6.1利用荧光标记示踪法检测Cx43对颈动脉损伤大鼠中EPCs归巢的影响,荧光显微镜下观察并计数,生理盐水组(saline组)血管内膜处未见到绿色荧光标记的EPCs;另外3组在血管内膜处均可见绿色荧光标记的EPCs。VEGF-EPCs组EPCs归巢数量增加(VEGF-EPCs组vs EPCs组,15.67±2.08个vs 5.00±2.00个,p0.01)(n=3)(×100),而抑制Cx43表达,EPCs归巢数量减少(VEGF-EPCs组vs VEGF-si Cx43-EPCs组,15.67±2.08个vs 10.67+2.08个,p0.05)(n=3)(×100)。3.6.2在血管损伤7天后使用伊文氏蓝(evans blue)染色的方式检测损伤血管再内皮化的情况。已经完成再内皮化的部位不着色,没有完成再内皮化的部位会被evans blue染为蓝色。根据实验方法所述,计算再内皮化率来评价损伤血管再内皮化程度。移植EPCS可促进损伤血管再内皮化(EPCs组vs saline组,18.39±1.83%vs 5.51±1.18%,p0.01)(n=3);VEGF-EPCs组损伤血管内再内皮化增强(VEGF-EPCs组vs EPCs组,52.66±3.78%vs 18.39±1.83%,p0.01)(n=3),而抑制Cx43的表达,再内皮化减弱(VEGF-EPCs组vs VEGF-si Cx43-EPCs组,52.66±3.78%vs 29.58±2.44%,p0.01)(n=3)。3.6.3在血管损伤14天后先进行HE染色,通过软件分别测定内膜(I)和中膜(M)的面积,通过内膜和中膜面积的比值(I/M)来评价Cx43对损伤血管内膜增生的作用。结果显示:移植EPCs可抑制内膜增生(EPCs组vs saline组,0.714±0.024 vs0.835±0.025,p0.01)(n=3);VEGF-EPCs组内膜增生减弱(VEGF-EPCs组vs EPCs组,0.278±0.018 vs 0.714±0.024,p0.01)(n=3),而抑制Cx43的表达,内膜增生加重(VEG-EPCs组vs VEGF-si Cx43-EPCs组,0.278±0.018 vs 0.402±0.116,p0.01)(n=3)。4.结论4.1大鼠脾脏中分离的单个核细胞通过定向培养可获得EPCs。4.2 Cx43可在EPCs中表达,分布于细胞质和细胞膜上。4.3 VEGF可以促进Cx43的表达,且呈浓度依赖性;si RNA可以有效抑制EPCs中Cx43的表达。4.4 VEGF通过增加Cx43的表达增强相邻EPCs间缝隙连接功能,从而增强细胞间的能量和物质交换。4.5 VEGF可通过增加Cx43的表达促进EPCs增殖,迁移。4.6 VEGF可通过增加Cx43的表达促进EPCs的归巢及损伤血管再内皮化,抑制内膜增生。
【关键词】：内皮祖细胞 血管内皮生长因子 缝隙连接蛋白43 增殖 迁移 血管损伤 再内皮化 内膜增生
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 英文缩写一览表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-15
• 第二章 VEGF调控Cx43对EPCs增殖，迁移的影响15-31
• 2.1 实验材料15-17
• 2.2 实验方法17-22
• 2.3 结果22-29
• 2.4 讨论29-30
• 2.5 小结30-31
• 第三章 VEGF调控Cx43对颈动脉血管损伤修复的影响31-40
• 3.1 实验材料31-32
• 3.2 实验方法32-34
• 3.3 结果34-39
• 3.4 讨论39
• 3.5 小结39-40
• 全文结论40-41
• 参考文献41-45
• 文献综述 缝隙连接蛋白CX43在心血管疾病中的研究进展45-55
• 参考文献50-55
• 研究生期间发表论文55-56
• 致谢56

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