不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底对内皮细胞生物力学行为的影响

发布时间：2017-10-18 09:48

  本文关键词：不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底对内皮细胞生物力学行为的影响

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【摘要】：心血管疾病(Cardio Vascular Disease,CVD)是全球人口发病率和死亡率最高的疾病之一,而动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)则是主要的心血管类疾病之一。在动脉粥样硬化疾病发生发展过程中,由于血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖迁移、基质胶原大量沉积、细胞外基质蛋白交联等,血管壁硬度逐渐增加。随着刚度增加,血管壁内皮层渗透性增加,白细胞转移增加,这也是动脉粥样硬化病变过程的标志之一。目前,对动脉粥样硬化发病机理的研究多从VSMCs、炎症细胞等入手,而从力学角度研究基底刚度与内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)相互作用的并不多见,血管病变过程中血管壁刚度的变化对血管内皮细胞的铺展、粘附、迁移等生物力学行为的影响及其可能的分子学机制,目前尚无定论。为了弄清内皮细胞在动脉粥样硬化病变发展过程中对血管壁硬度变化的生物力学响应,从而更好地维护心血管的健康,本研究利用聚丙烯酰胺水凝胶(Polyarcylamide gel,PA gel),设计制备不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底,模拟血管正常生理状态和病变不同阶段血管壁硬度,分析不同硬度基底对血管内皮细胞骨架组装、细胞铺展和迁移等行为的影响。在此基础上,通过对“细胞外基质—整合素—黏着斑—细胞骨架”这条与细胞铺展迁移密切相关的信号轴上关键蛋白表达及其在细胞内的分布,探寻基底硬度调控细胞铺展、迁移等行为的作用规律。本文的主要内容和结果:①聚丙烯酰胺凝胶基底的制备、表面修饰及表征。丙烯酰胺单体、甲叉双丙烯酰胺交联剂按不同配比聚合,动静态疲劳试验机测得不同配比丙烯酰胺水凝胶的杨氏模量E分别为11.12k Pa、33.01k Pa、57.61k Pa、80.66k Pa,可以较好的地模拟正常血管及病变血管的硬度。各硬度PA胶表面用I型鼠尾胶原(Col-I)修饰,原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)扫描分析修饰后的凝胶表面形貌显示,PA胶表面粗糙度为1.682E+01nm,表面有锥形凸起,但最高不超过200nm。②基底硬度对内皮细胞形貌、铺展、极化行为的影响。不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养,细胞免疫荧光分析细胞骨架纤维组装和排列随基质硬度的变化。在较软基底表面生长的细胞,细胞骨架纤维短小、纤细,无法形成明显纤维束,随着基底硬度增加,骨架纤维变长变粗,形成相互交联的网状纤维束,基底硬度越高,骨架纤维交联度也越高;在较高硬度基底上,细胞骨架纤维排列发生极化,排列方向与细胞长轴方向基本平行。利用活细胞工作站实时观察记录细胞形貌、铺展、极化随基底硬度的动态变化。在较软基底表面,内皮细胞呈圆形,铺展面积小,随着基底硬度增加,细胞在基底表面的铺展面积增大,细胞长短径比率增大;在80.66k Pa的较硬基底上,细胞极化现象明显,呈梭型,并出现伸长的尾部。③基底硬度对内皮细胞迁移行为的影响。不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底与内皮细胞共培养,活细胞工作站实时观察记录细胞迁移行为。单个HUVEC细胞迁移速率和位移均随基底硬度增加而增大;细胞在软基底上运动比较随机,方向变化较快,而较硬基底表面,细胞运动更规律。④基底硬度对细胞内力响应蛋白分布及含量的影响。人脐静脉内皮细胞分别在不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底上培养48h,分别用免疫荧光和免疫印迹检测黏着斑蛋白vinculin和非肌肉型II型肌球蛋白(Non-muscle myosin II,NM II)在细胞内的分布和表达情况。Vinculin表达量随基底硬度增加而单调增加;NM II呈点状弥散分布于细胞质中,且随基底硬度增加,其表达量增加。
【关键词】：基底硬度 内皮细胞 细胞铺展 细胞迁移 非肌肉型II型肌球蛋白
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-7
• 主要缩略词表7-11
• 1 绪论11-20
• 1.1 问题的提出与研究意义11-12
• 1.1.1 问题的提出11-12
• 1.1.2 研究意义12
• 1.2 国内外研究现状12-17
• 1.2.1 细胞外基质微环境力学特性与细胞12-13
• 1.2.2 基底刚度与细胞骨架、细胞形貌及铺展13
• 1.2.3 基底刚度与细胞粘附、迁移13-14
• 1.2.4 基底刚度影响细胞生物力学行为的内在机制14-15
• 1.2.5 基底刚度、细胞张力与非肌肉型II型肌球蛋白15-17
• 1.3 本文的研究目的、研究内容和技术路线17-19
• 1.3.1 研究目的17-18
• 1.3.2 研究内容18-19
• 1.3.3 技术路线19
• 1.4 本研究的创新点19-20
• 2 聚丙烯酰胺水凝胶基底制备、表面处理及性能检测20-29
• 2.1 引言20-21
• 2.2 实验仪器与试剂21
• 2.3 聚丙烯酰胺水凝胶基底制备、表面处理及性能检测21-24
• 2.3.1 聚丙烯酰胺水凝胶制备原理21-22
• 2.3.2 聚丙烯酰胺水凝胶基底制备22
• 2.3.3 聚丙烯酰胺水凝胶表面处理22-24
• 2.3.4 聚丙烯酰胺水凝胶性能检测24
• 2.3.5 实验数据统计分析24
• 2.4 结果分析与讨论24-27
• 2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶（Col-I修饰）表面形貌检测24-26
• 2.4.2 聚丙烯酰胺水凝胶杨氏模量测定26-27
• 2.5 本章小结27-29
• 3 基底硬度对人脐静脉内皮细胞形貌、细胞铺展行为的影响29-38
• 3.1 引言29
• 3.2 实验仪器与试剂29-31
• 3.3 不同硬度聚丙烯酰胺水凝胶基底对内皮细胞形貌、铺展行为影响31-32
• 3.3.1 不同硬度PA胶基底制备及表面修饰31
• 3.3.2 不同硬度PA胶表面细胞培养31
• 3.3.3 活细胞工作站实时观察不同硬度PA胶表面单细胞形貌、铺展情况31
• 3.3.4 细胞骨架免疫荧光检测31-32
• 3.3.5 实验数据统计分析32
• 3.4 结果分析与讨论32-36
• 3.4.1 基底硬度对人脐静脉内皮细胞形貌和铺展面积的影响32-35
• 3.4.2 基底硬度对人脐静脉内皮细胞极化性能影响35-36
• 3.4.3 基底硬度对人脐静脉内皮细胞骨架纤维组装、排列的影响36
• 3.5 本章小结36-38
• 4 基底硬度对人脐静脉内皮细胞迁移行为的影响38-44
• 4.1 引言38
• 4.2 实验仪器与试剂38-39
• 4.3 基底硬度对人脐静脉内皮细胞迁移行为的影响39-40
• 4.3.1 不同硬度PA胶基底制备及表面修饰39-40
• 4.3.2 不同硬度PA胶表面细胞培养40
• 4.3.3 活细胞工作站实时检测不同硬度PA胶表面内皮细胞铺展、迁移40
• 4.3.4 实验数据统计分析40
• 4.4 结果分析与讨论40-42
• 4.4.1 人脐静脉内皮细胞在不同硬度基底上运动参数分析40-41
• 4.4.2 人脐静脉内皮细胞在不同硬度基底上细胞运动方向分析41-42
• 4.5 本章小结42-44
• 5 基底硬度对内皮细胞相关力学响应蛋白分布及表达的影响44-52
• 5.1 引言44
• 5.2 实验仪器与试剂44-46
• 5.3 基底硬度对内皮细胞相关力学响应蛋白分布及表达的影响46-49
• 5.3.1 不同硬度PA胶基底制备及表面修饰46
• 5.3.2 不同硬度PA胶表面细胞培养46
• 5.3.3 细胞内力学响应蛋白免疫荧光染色46-47
• 5.3.4 免疫印迹47-48
• 5.3.5 实验数据统计分析48-49
• 5.4 结果分析与讨论49-51
• 5.4.1 基底硬度对黏着斑蛋白Vinculin表达的影响49-50
• 5.4.2 基底硬度对非肌肉型II型肌球蛋白在细胞内分布及表达影响50-51
• 5.5 本章小结51-52
• 6 结论与展望52-54
• 6.1 主要结论52-53
• 6.2 存在的不足和后续工作建议53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-60
• 附录60
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文60
• B. 作者在攻读硕士学位期间曾参与的科研项目60

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