CALR基因在MDS患者中的表达及其RNAi慢病毒载体对细胞生长和凋亡的影响

发布时间：2017-10-18 16:19

  本文关键词：CALR基因在MDS患者中的表达及其RNAi慢病毒载体对细胞生长和凋亡的影响

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【摘要】：目的:研究骨髓增生异常综合征(MDS)患者中钙网织蛋白基因(Calreticulin,CALR)的表达,并构建CALR-RNAi慢病毒载体,观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞生长和凋亡的影响。方法:收集重庆医科大学附属第一医院血液科2010年~2014年的34例MDS患者骨髓标本和8例非MDS患者骨髓标本。按照WHO分型诊断标准和MDS国际预后积分系统,将实验组34例患者分为高危组和低危组,对照组取另外8例同期非MDS患者的骨髓标本。所有骨髓标本通过分离单个核细胞提取总RNA,逆转录制备为cDNA,使用RT-PCR技术检测两组骨髓标本及SKM-1细胞中CALR的相对表达水平。首先查询GenBank中CALR(human)的碱基序列,然后使用RNAi软件设计3条RNAi靶序列、1条阴性对照序列。合成RNAi靶序列的单链DNA oligo,退火配对产生双链,T4 DNA连接酶连接酶切后的慢病毒载体,转化感受态大肠杆菌,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定,完成RNAi慢病毒载体的制备。共转染293T细胞进行包装得到3种GV-CALR-RNAi重组慢病毒载体。病毒滴度采用逐孔稀释法进行测定。三种GV-CALR-RNAi重组慢病毒分别稳定转染至SKM-1细胞中,通过流式细胞术检测转染效率。后收集各组细胞,分别提取总rna及蛋白,通过rt-pcr检测各组细胞calrmrna表达及westernblot技术检测各组细胞calr蛋白质的表达以验证干扰效果,筛选出最佳靶向序列。使用含最佳靶向序列的慢病毒载体转染skm-1细胞,cck-8法检测干扰calr基因的表达对skm-1细胞生长的影响,流式细胞术观察其对细胞周期的影响,annexinv/7-aad双染法用流式细胞术观察对细胞凋亡的影响,westernblot检测凋亡蛋白caspase-3的水平。结果:应用rt-pcr技术检测34例低、高危mds标本的calr表达,绝大多数标本calr基因表达明显降低,显著低于正常对照组(p0.01)。同时,检测到人mds细胞株skm-1细胞中calr表达较正常对照明显降低(p0.01)构建的3组calr-rnai重组慢病毒转染人mds细胞株skm-1后,倒置显微镜下观察gfp荧光逐渐增强,至培养第5天表达最强,calr-rnai(2)、calr-rnai(3)慢病毒干扰组流式细胞术检测转染效率均在70%以上,而calr-rnai(1)慢病毒干扰组流式细胞术检测转染效率在50%以下。rt-pcr检测转染后第5天实验组calr-mrna表达水平,结果显示calr-rnai(3)慢病毒载体与阴性对照组及空白对照组相比能有效降低calrmrna表达水平[(0.40±0.11),p0.01]。westernblot检测结果也证实,calr-rnai(3)能有效敲除calr蛋白的表达,确定为最佳靶点在SKM-1细胞中转染CALR-RNAi(3)慢病毒及阴性对照组慢病毒,通过CCK-8法检测SKM-1细胞的生长,发现CALR-RNAi(3)通过干扰CALR表达可促进SKM-1细胞生长,细胞生长第5天统计学差异显著(P0.05)。流式细胞术检测实验组和对照组细胞周期情况,结果显示CALR-RNAi(3)组G0/G1期细胞比例(45.25±4.45)%低于空白对照组(54.12±1.36)%和阴性对照组(54.67±1.26)%,且差异具有统计学意义(P=0.019,P=0.014);而CALR-RNAi(3)组S期细胞比例细胞比例为(46.15±2.99),明显高于空白对照组和阴性对照组[(38.42±2.11)%和(36.23±3.25)%,P0.05。AnnexinV/7-AAD双染法用流式细胞仪检测凋亡细胞,发现CALR-RNAi(3)组较阴性对照组和空白对照组细胞凋亡减少(图7),且有显著性差异(P0.05)。用Western blot检测各组细胞中cleaved-caspase-3的表达。结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,cleaved-caspase-3的表达在CALR-RNAi(3)组中明显降低。结论:CALR基因在MDS中起到抑癌基因的作用,构建的GV-CALR-RNAi(3)重组慢病毒载体有利于进一步研究CALR基因在MDS中的作用机制。
【关键词】：钙网蛋白基因(CALR) RNA干扰 细胞生长 细胞凋亡 骨髓增生异常综合征(MDS)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R551.3
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-13
• 第一部分 CALR基因在骨髓增生异常综合征患者中的表达水平及其RNAi慢病毒载体的构建13-28
• 1 材料与方法13-20
• 2 结果20-25
• 3 讨论25-26
• 4 结论26
• 5 参考文献26-28
• 第二部分 干扰CALR基因表达对骨髓增生异常综合征细胞系SKM-1 细胞生长和凋亡的影响28-36
• 1 材料与方法28-31
• 2 结果31-33
• 3 讨论33-34
• 4 结论34
• 5 参考文献34-36
• 全文总结36-37
• 文献综述：CALR基因在骨髓增生异常综合征中的作用37-45
• 参考文献41-45
• 致谢45-46
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文46

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 孟凡荣;陈琛;万海粟;周清华;;慢病毒载体及其研究进展[J];中国肺癌杂志;2014年12期

2 肖志坚;;骨髓增生异常综合征研究进展[J];临床血液学杂志;2013年04期

3 Shikha Snigdha;Erica D Smith;G Aleph Prieto;Carl W Cotman;;Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J];Neuroscience Bulletin;2012年01期

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本文编号：1055929