聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-21 18:27

  本文关键词：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在糖尿病心肌病中的作用及机制研究

  更多相关文章： 糖尿病心肌病 PARP-1 高糖血症 炎症反应 凋亡

【摘要】：背景糖尿病是一种慢性,渐进性的代谢性疾病,其主要特征是胰岛素缺乏和/或抵抗,导致血浆葡萄糖水平的升高,并且确实是21世纪人类健康的一大威胁,由于发病率的上升,其状况令人担忧,在过去二十年里,吸引了相当多的关注。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者心功能不全且没有冠状动脉硬化和高血压因素的影响,它也是人类健康的一大威胁,也是亟待解决的临床问题。根据本课题组之前的研究结果,高血糖能够诱导大鼠心肌细胞凋亡,因此本实验使用葡萄糖刺激大鼠心肌细胞,构建高血糖细胞模型,高糖刺激是否引起细胞氧化应激和DNA损伤,并且影响PARP-1表达和活性。PARP-1在高糖导致的炎症反应和凋亡信号通路中扮演着什么样的作用。PARP-1在氧化应激和DNA损伤中扮演者重要的角色。本实验对PARP-1进行干预,以期阐明PARP-1在糖尿病心肌病中的潜在作用机制以及找到治疗糖尿病心肌病的可行的治疗方法。目的构建小鼠糖尿病心肌病疾病模型,研究PARP-1在糖尿病心肌病中的潜在作用机制,同时构建心肌细胞高血糖模型,进一步研究PARP-1在心肌细胞凋亡中的具体调控机制。方法小鼠糖尿病心肌病建模,20只10周龄雄性C57BL/6野生型小鼠和20只10周龄雄性PARP-1基因敲除小鼠(美国杰克森实验室),模型组小鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ),剂量为50mg/kg,对照组小鼠腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液,连续注射5天。从小鼠尾静取少量血液,使用罗氏血糖仪检测小鼠血糖变化,如果小鼠随机血糖浓度16.7 mmol/l,则认为小鼠糖尿病模型建模成功。老鼠被饲养在无病原微生物的动物房并且确保有足够的食物和水。用琼脂糖凝胶PCR鉴定PARP-1敲基因小鼠的基因型。老鼠取材前进行超声心动图检测,心脏直径和功能用加拿大小动物成像仪检测。检测左心室射血分数,缩短分数,E/A峰(二尖瓣血流速度),左心室舒张末期内径。所有的测量必须在统一观测条件下的5个心动周期。尾静脉测量小鼠心率,收缩压和舒张压。之后收集老鼠心肌标本,用Western Bolt and RT-PCR检测基因和蛋白表达情况,HE染色和免疫组化观察心脏形态学变化。培养细胞并造高血糖心肌细胞模型,PARP-1干预之后用Western Blot and Realtime-PCR检测心肌细胞相关炎症因子和凋亡因子变化,阐明PARP-1在糖尿病心肌病中的潜在作用机制。结果(1)高糖通过诱导DNA损伤增加了PARP-1的活性和表达。(2)PARP-1抑制剂在体外实验中减轻了高糖引起的炎症因子上调。(3)PARP-1抑制剂减轻了高糖诱导的细胞凋亡。(4)PARP-1抑制剂在体外实验中增加了IGF-1R/Akt的磷酸化水平。(5)PARP-1缺失恢复了糖尿病小鼠的心功能并且减轻了高糖血症引起的心肌重塑。(6)高糖血症增加了硝基酪氨酸的水平并且增加了PARP-1的活性和表达。结论1、在体外,高糖刺激增加了氧化应激并且增加了高糖诱导的DNA损伤引起的PARP-1的活性和表达。PARP-1干扰显著地减少了高糖引起的炎症因子表达,包括TNF-α,IL-1β,IL-6,ICAM-1和iNOS。同时PARP-1干扰通过下调乳沟半胱天冬酶和激活IGF-1R/Akt信号通路减轻了心肌细胞凋亡。2、在体内,高糖血症增加了硝基酪氨酸的表达和PARP-1的活性和表达。与正常小鼠相比,PARP-1缺失显著地减少了高糖血症引起的细胞凋亡和炎症反应,并改善了心肌的组织学异常和心功能。
【关键词】：糖尿病心肌病 PARP-1 高糖血症 炎症反应 凋亡
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R542.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略词表11-13
• 引言13-15
• 1 前言15-17
• 2 材料、仪器与试剂17-23
• 2.1 材料与试剂17-18
• 2.2 仪器18-20
• 2.3 部分溶剂配制方法20-23
• 3 实验方法23-33
• 3.1 动物模型建立23
• 3.2 动物模型指标检测23-25
• 3.3 细胞培养与干预25-27
• 3.4 总RNA提取27
• 3.5 引物设计27
• 3.6 实时定量PCR检测27-28
• 3.7 小鼠基因型的鉴定28-29
• 3.8 彗星实验29
• 3.9 ELISA29
• 3.10 Western Blot蛋白凝胶电泳29-31
• 3.11 流式细胞术31
• 3.12 统计学分析31-33
• 4 实验结果33-43
• 4.1 动物模型的成功构建33-34
• 4.1.1 小鼠基因型的结果鉴定33
• 4.1.2 各组小鼠一般情况33
• 4.1.3 小鼠的通用指标检测33-34
• 4.2 形态学观察及部分基因检测34-38
• 4.2.1 小鼠心肌HE染色34-35
• 4.2.2 小鼠心动超声结果35-36
• 4.2.3 小鼠心肌凋亡相关指标检测36-37
• 4.2.4 小鼠心肌炎症反应相关指标检测37-38
• 4.3 分子学实验检测38-43
• 4.3.1 氧化应激以及DNA损伤检测38-39
• 4.3.2 细胞炎症因子表达检测39-40
• 4.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡40-41
• 4.3.4 信号通路蛋白检测41-43
• 讨论43-45
• 结论45-47
• 参考文献47-50
• 综述 糖尿病心肌病的研究进展50-59
• 参考文献55-59
• 致谢59-61
• 在读期间参加的学术会议及研究成果61-62

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本文编号：1074721