氧化型低密度脂蛋白协同机械牵张力对巨噬细胞ROS的诱导与机制探讨

发布时间：2017-10-22 17:24

  本文关键词：氧化型低密度脂蛋白协同机械牵张力对巨噬细胞ROS的诱导与机制探讨

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【摘要】：目的:动脉粥样斑块病变的重要成分泡沫细胞主要有两种来源:血管平滑肌细胞和巨噬细胞。前期我们已经证实,高血压产生的机械牵张力(SS)和/或高血糖产生的晚期糖基化终末产物(AGEs)可激活血管平滑肌细胞的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路和活性氧(ROS)氧化应激通路;SS和/或氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)可激活巨噬细胞ERK1/2信号通路.但是SS和/或oxLDL对巨噬细胞的ROS氧化应激通路的影响尚不清楚;这两种致病因素对巨噬细胞ROS的产生与ROS氧化应激通路的上游分子,NADPH氧化酶(主要是Nox1)的关系尚不清楚;前期有报道称动脉粥样硬化的常用调血脂药辛伐他汀可减缓血管重塑的进展,此作用与巨噬细胞的氧化应激的关系及其具体机制亦尚不清楚。以上是本课题主要关注的问题,为进一步补充发展本课题组之前提出的“高血压机械力非特异性激活多条信号通路”的学说,深入SS和oxLDL引起血管重构的机制探讨、临床寻找防治高血压或合并高血脂患者的新靶点提供实验资料。实验方法:(1)从ATCC购得巨噬细胞RAW264.7,用DMEM高糖培养基及浓度为10%的标准胎牛血清培养。待细胞长满,使用塑料细胞刮传代。(2)从人血浆中提取的低密度脂蛋白(LDL),同氧化后形成的oxLDL,用外观颜色和琼脂糖电泳相鉴别。将细胞以2×104的密度接种于六孔板上,待细胞生长至80%融合时,换用无血清的培养基饥饿处理12小时后,按照实验要求施加不同处理因素。(3)用Hoechst 33342染料标记产生ROS的巨噬细胞的细胞核,检测细胞核被标记的数目;采用H2DCFDA荧光探针,检测oxLDL或/和SS作用下巨噬细胞ROS的产生情况。(4)应用NADPH氧化酶抑制剂(罗布麻宁/apocynin)预处理巨噬细胞后,施加不同处理因素,重复(3)实验步骤。(5)应用辛伐他汀预处理巨噬细胞后,施加不同处理因素,重复(3)实验步骤。(6)应用辛伐他汀预处理后,通过Western Blot检测SS介导的巨噬细胞Nox1的表达。(7)应用辛伐他汀预处理后,通过Western Blot检测SS和oxLDL单独或联合介导的巨噬细胞MAPKs的表达。结果:(1)采用ATCC购买的巨噬细胞RAW264.7细胞系,细胞呈圆形,胞核位于中央,半贴壁生长。(2)LDL液体呈均一淡黄色,通透且无沉淀;氧化后呈乳白色,无沉淀。(3)oxLDL和SS单独作用均可以诱导巨噬细胞RAW264.7 ROS水平升高,并呈现时间或浓度(强度)依赖性。(4)oxLDL和SS联合作用可促进巨噬细胞RAW264.7 ROS水平进一步升高,高于任一单独因素的作用,呈现协同效应。(5)应用Nox1抑制剂预处理后,oxLDL或/和SS诱导的ROS生成减少。表明oxLDL和SS所引起的巨噬细胞RAW264.7 ROS的产生与Nox1的激活有关。(6)辛伐他汀预处理后,oxLDL或/和SS介导的ROS生成减少,并且随着辛伐他汀浓度增高,其抑制巨噬细胞RAW264.7ROS产生的作用越显著。(7)辛伐他汀可以抑制oxLDL或/和SS介导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 MAPKs的表达。结论:(1)oxLDL和SS可分别诱导巨噬细胞ROS水平升高,而两者联合刺激可促进胞内ROS水平的进一步升高,呈协同效应,导致ROS大量蓄积而触发氧化应激反应,参与并加速血管重构。而此过程中所生成的ROS部分来源于Nox1的激活。(2)辛伐他汀参与调控oxLDL或SS作用下巨噬细胞Nox1的激活,导致了ROS水平的降低。并且,辛伐他汀可以抑制oxLDL或/和SS介导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 MAPKs的表达。(3)本课题初步探究了高血脂oxLDL与高血压SS单独和联合作用下诱导巨噬细胞ROS生成的分子机制,并且进一步补充发展了我们先前提出的“高血压机械力非特异性激活多条信号通路”的学说,为深入高血压SS以及高血脂oxLDL引起血管重构的机制探讨以及临床中寻找防治高血压或合并高血脂患者的新靶点提供实验依据。
【关键词】：氧化型低密度脂蛋白 机械牵张力 巨噬细胞 活性氧 NADPH氧化酶 辛伐他汀 高血压 高血脂 血管重构
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-12
• 前言12-20
• 第1章 巨噬细胞的培养20-25
• 1.1 材料20-21
• 1.2 方法21-23
• 1.3 结果23
• 1.4 讨论23-25
• 第2章 oxLDL的制备与鉴定25-32
• 2.1 材料25-27
• 2.2 方法27-29
• 2.3 结果29-30
• 2.4 讨论30-32
• 第3章 SS与oxLDL单独/联合刺激对巨噬细胞ROS产生的影响32-43
• 3.1 材料33-34
• 3.2 方法34-36
• 3.3 结果36-42
• 3.4 讨论42-43
• 第4章 SS、oxLDL单独/联合刺激介导巨噬细胞产生的ROS源于Nox1的激活43-52
• 4.1 材料44-45
• 4.2 方法45-46
• 4.3 结果46-51
• 4.4 讨论51-52
• 第5章 辛伐他汀对SS、oxLDL刺激介导小鼠巨噬细胞RAW264.7 产生ROS的影响52-61
• 5.1 材料52-54
• 5.2 方法54-55
• 5.3 结果55-60
• 5.4 讨论60-61
• 第6章 辛伐他汀抑制SS和/或oxLDL引起的巨噬细胞RAW264.7MAPKs磷酸化61-69
• 6.1 材料61-62
• 6.2 实验方法62-65
• 6.3 结果65-67
• 6.4 讨论67-69
• 结论69
• 创新性69-70
• 参考文献70-78
• 在校期间的科研成果78
• 基金项目支持78-79
• 主要英文缩写词汇表79-80
• 致谢80

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本文编号：1079350