RNA干扰靶向沉默SPAG6基因对人MDS细胞体内外生长的影响

发布时间：2017-11-05 01:26

  本文关键词：RNA干扰靶向沉默SPAG6基因对人MDS细胞体内外生长的影响

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【摘要】：目的构建靶向沉默SPAG6基因的pGC-SPAG6-shRNA重组慢病毒载体,从体内外两方面探讨SPAG6基因对人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞生长的影响,明确SPAG6基因在MDS发生中的作用。方法1、人SPAG6基因RNAi'慢病毒载体的构建及验证：以慢病毒pGC-GV-GFP为载体,设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA慢病毒表达载体。转染人MDS细胞株SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因的干扰效果,筛选最佳靶点。2、SPAG6-shRNA'漫病毒载体对SKM-1细胞生长的影响：利用qRT-PCR检测SPAG6在SKM-1细胞中的表达情况,CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,并利用qRT-PCR及Western blot检测部分凋亡相关分子的表达变化。3、SPAG6-shRNA慢病毒载体对SKM-1细胞生长影响的体内研究：SPAG6-shRNA及NC-shRNA慢病毒载体稳定感染SKM-1细胞,两组细胞分别接种于免疫缺陷的NOD/SCID小鼠皮下,建立MDS荷瘤小鼠模型。观察SPAG6基因干扰后移植瘤的生长情况,并利用TUNEL法检测肿瘤组织的原位细胞凋亡。结果1、SPAG6-shRNA慢病毒载体成功得到,流式细胞术检测转染效率均在60%以上。QRT-PCR及Western blot结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体的敲除效率最高,为最佳靶点。2、SPAG6在SKM-1细胞中表达明显增高,靶向沉默SPAG6基因后,SKM-1细胞的生长受抑,O1D值较阴性对照组相比降低(P0.05)。干扰组细胞的凋亡比例为(16.42±3.27)%,明显高于对照组[(4.12±0.52)%,P=0.024],而两组间的细胞周期并无明显统计学差异(P0.05)。另外,SPAG6干扰组细胞内caspase3、caspase8、caspase9及p53的表达水平明显增高。3、在NOD/SCID小鼠皮下成功建立SKM-1细胞移植瘤,SPAG6干扰组瘤块的体积及重量均小于对照组,并且TUNEL法结果显示干扰组瘤块组织的原位细胞凋亡率明显高于对照组(SPAG6-shRNA 48.33±2.52% vs. NC-shRNA 18.33±3.51%, P=0.000)结论SPAG6-shRNA慢病毒载体成功构建,能有效降低SPAG6基因mRNA及蛋白的表达水平。SPAG6基因在人MDS细胞株SKM-1中表达增高,利用SPAG6-shRNA'漫病毒靶向沉默SPAG6后,SKM-1细胞的生长受抑,细胞凋亡增加。其途径可能是SPAG6基因表达的降低可上调caspase蛋白及p53的表达,诱导凋亡信号通路的活化。提示高表达的SPAG6可能通过抑制MDS细胞的凋亡而促进其生长,为进一步研究MDS的靶向治疗提供理论依据和实验基础。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R551.3

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本文编号：1142010