alas1基因的缺失通过影响钙离子信号通路导致斑马鱼心脏功能障碍

发布时间：2017-11-16 20:27

  本文关键词：alas1基因的缺失通过影响钙离子信号通路导致斑马鱼心脏功能障碍

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【摘要】：血红素的合成是由八步酶催化的级联反应所组成的。反应的第一步是由甘氨酸和琥珀酰辅酶A在5-氨基酮戊酸合成酶(ALAS)的催化下缩合生成5-氨基酮戊酸(ALA)。ALA合成酶有两种同工酶:ALAS1和ALAS2,分别由基因alas1和alas2编码。alas1基因是一个管家基因,在所有的组织中都表达;而alas2是一个组织特异性的基因,仅在血红细胞中表达。alas2基因缺陷会导致先天性铁粒幼细胞性贫血症(ADP)。ALAS1是血红素合成的限速酶,血红素可以通过反馈调节ALAS1来抑制自身的合成。Alas1基因的缺失会影响小鼠的胚胎发育,纯合突变体小鼠只能存活8.5天。但是alas1基因在斑马鱼中的功能尚不清楚。本文利用CRISPR-Cas9技术构建了alas1基因的突变体来研究这个基因在斑马鱼中的具体功能。我们发现,alas1纯合突变的斑马鱼也是致死的,纯合突变的斑马鱼能存活11天左右。而且突变体在96 hpf或120 hpf时期表现出明显的心脏功能的缺陷,具体表现有心包水肿,心肌肿大,心跳缓慢等等。突变体斑马鱼的发育也比野生型斑马鱼缓慢,具体表现为突变体斑马鱼鱼鳔发育受到影响,在第五天不能自由游动。心脏标记基因的原位杂交结果表明,在120 hpf时期,cmlc2和vmhc这两个基因在突变体斑马鱼和野生型斑马鱼的表达位置有明显的差异。在突变体中,心房排钠肽基因nppa的表达充满了整个心脏。这些结果表明了alas1纯合突变体的心脏形态明显不同于野生型。为了对alas1纯合突变体心脏功能障碍的机制做出更详细的解析,本文选取52 hpf和120 hpf两个时间点对野生型和纯合突变体进行了转录组测序的分析。结果发现,在120 hpf时期,有许多参与心脏收缩和舒张功能的基因的表达量显著下调,这说明alas1纯合突变体的心脏收缩和舒张功能受到影响。在52 hpf时期负责钙离子转运的相关基因atp2a1l的表达量明显下调,这个基因的下调也许是引起alas1纯合突变体的心脏收缩和舒张功能障碍的主要原因。细胞实验结果显示血红素和转录因子Nrf2a-Mafk都能激活atp2a1l基因的启动子。拯救实验也表明了血红素和alas1 mRNA能够使突变体的atp2a1l基因的表达水平恢复。这些结果说明了血红素通过Nrf2a/Bach1b-Mafk通路参与调节atp2a1l基因的表达。卟啉症(porphyria)是一种由血红素合成过程中的酶的功能缺陷导致的疾病。血红素合成过程中第四步反应的催化酶为UROS,该酶的功能缺失会导致先天红细胞性的卟啉症(CEP)。本文运用CRISPR-Cas9技术建立了斑马鱼uros基因缺陷的突变体,作为人类先天红细胞性的卟啉症的疾病模型。通过对突变体的表型分析,我们发现突变体的血红素含量显著减少,血红蛋白含量显著下降,血红素合成过程中的代谢产物积累引起了自发的荧光,同时血红素合成通路中的相关基因表达水平异常。此外,显微注射人的UROS mRNA到突变体胚胎中能够拯救突变体的表型。本文首次构建了斑马鱼alas1纯合突变体,发现alas1纯合突变体心脏功能减弱,而且还发现了血红素参与调控的一个新的下游基因。本文还建立了一种人类卟啉症的斑马鱼CEP疾病模型,为CEP的病理机制研究提供了重要的动物模型,并为治疗卟啉症的药物筛选工作奠定了基础。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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