血清淀粉样P物质对巨噬细胞炎症反应以及氧化应激的影响及机制

发布时间：2017-11-18 15:15

  本文关键词：血清淀粉样P物质对巨噬细胞炎症反应以及氧化应激的影响及机制

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【摘要】：第一部分血清淀粉样P物质对巨噬细胞炎症反应以及氧化应激的影响及机制研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是当今世界发病率乃至死亡率最高的疾病之一。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)则是ASCVD最基本的的病理生理学基础,动脉粥样硬化的具体发生机制,现仍未完全明确,目前最公认的主要是血栓形成学说、脂质浸润学说、损伤反应学说和炎症学说等,无论是脂质沉积、炎症反应、氧化应激等都是AS形成的主要的病理特征,也是促进AS发生发展的重要因素。血脂代谢异常是其重要的危险因素之一,体内氧化应激反应的增加,产生大量的活性氧、活性氮离子,促进低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的氧化修饰,形成的氧化低密度脂蛋白(oxdized low-density lipoprotein, Ox-LDL)极易损伤内皮功能、促进胆固醇的内皮下沉积和激活巨噬细胞迁移与吞噬,最终形成泡沫细胞并激活进一步的炎症反应,加速AS的演变。多项研究证明,炎症、免疫反应参与了动脉粥样硬化的形成与发展的各个阶段,白介素(interleukins, IL)、干扰素(interferons, IFN)、肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor, TNF)等炎症因子在粥样斑块中有表达,而且几乎所有与动脉粥样硬化发生发展相关的细胞均可以分泌细胞因子,并且对相应的细胞因子产生免疫应答,这也是炎症、免疫反应成为影响AS进程的重要因素之一,也是防治AS的重要靶点之一。血清淀粉样P (Serum amyloid P, SAP)物质与C反应蛋白(C reactive protein,CRP)和正五聚蛋白3(pentraxin 3, PTX3)同属正五聚体家族,它们与炎症免疫反应有着不可分割的联系。最初SAP是作为一种淀粉样沉积蛋白为人们所认识,认为其在系统性淀粉样变性疾病的发生发展中有着重要作用,后来,研究逐渐发现SAP参着与体内的固有免疫、炎症反应、淀粉样变等多种活动,近年来SAP在心血管方面的作用也渐渐为人们所认识。研究发现,冠心病患者血液中SAP的浓度要明显高于正常人,在不稳定性心绞痛的患者中尤为显著,但是其在心血管疾病中的具体病理生理作用却并不十分明确。研究目的通过不同浓度的SAP作用RAW264.7细胞,观察SAP对RAW264.7分泌炎症因子、产生氧化应激产物等的影响,并且观察其对炎症相关的机制蛋白的影响,探寻SAP对炎症免疫反应作用的可能机制。研究方法1.细胞培养与实验分组：细胞接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM完全培养基,在每次实验前将巨噬细胞密度调整为1×10+个／孔,加入6孔板中,无血清培养基饥饿24h后,对照组不予以处理,SAP组加入不同浓度SAP刺激24h后,收取样本检测。实验分为4组：1)空白对照组,2)SAP 1.25ug/ml组,3)SAP 2.5ug/ml组,4)SAP 5ug/ml组2.不同浓度的SAP对RAW264.7细胞炎症反应和氧化应激的影响用不同浓度的SAP作用RAW264.7细胞24h后,收集细胞上清,用ELISA检测细胞上清炎症因子白介素1-β(interleukin-1β)、肿瘤坏死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a, TNF-a)以及氧化应激指标一氧化氮(Nitric Oxide, NO)的分泌,用流式细胞术检测细胞表面细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)及炎症相关Fcy受体的表达,并用RT-PCR复测IL-1β、 TNF-a及ICAM-1 mRNA的表达。3.不同浓度的SAP对炎症相关机制蛋白的影响用不同浓度的SAP作用RAW264.7细胞24h后,RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测Fcγ受体通路下游蛋白脾酪氨酸蛋白激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)的表达,以及炎症相关的MAPK家族蛋白细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK 1/2)、磷酸化ERK1/2 (pERK)的表达。4.统计学处理所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS20.0统计软件进行两样本均数比较的独立样本t检验分析,多组间总体均数比较,在方差齐时采用单向方差分析(one-way ANO VA),方差不齐时采用Welch校正检验。多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett's T3检验,P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.不同浓度的SAP对细胞上清中IL-1β、TNF-α、 ICAM-1及活性氮NO的分泌的影响结果显示,SAP可促进炎症因子IL-1β、 TNF-α、ICAM-1以及活性氮NO的分泌,且这种作用有一定的浓度依赖性。与空白对照组相比,SAP三组中IL-1β的表达量均明显升高,2.5ug/ml及5ug/ml组的fNF-a相较对照组与1.25ug/ml组均有明显升高趋势,5ug/ml组的ICAM-1和NO分泌相较于对照组和1.25ug/ml组均明显升高,结果具有统计学意义,其余几组之间并无统计学差异,但是仍有随浓度升高分泌增加的趋势。2.不同浓度SAP对炎症因子IL-1β、TNF-α、ICAM-1 mRNA表达的影响结果显示,与空白对照组相比,加入SAP刺激之后,三种炎症因子的nRNA表达量均有明显增高,且有一定的浓度依赖性。5ug/ml组的三种炎症因子分泌与其他三组之间均有明显升高趋势,2.5ug/ml组的IL-1β、TNF-α的mRNA表达相较于空白对照组和1.25ug/ml组均有升高,结果均具有统计学意义,其余几组之间并无统计学差异,但是仍有随浓度升高分泌增加的趋势。3.不同浓度的SAP对炎症相关机制蛋白的影响SAP刺激后Syk明显增加,相较于空白对照组,1.25ug/ml、2.5ug/ml、 5ug/ml组Syk表达量明显增加,差异具有统计学意义,且2.5ug/ml组与5ug/ml组相较1.25ug/ml组Syk表达量亦有升高,差异具有统计学意义。而SAP作用后Fcγ受体、pERK 1/2的表达并无明显改变,和空白对照组相比并无统计学意义。研究结论本研究通过观察不同浓度SAP对炎症免疫以及氧化应激的作用,发现SAP与Fcγ受体结合后,不改变Fcy受体的表达,通过增加Syk的表达,增加炎症因子IL-1β、TNF-α以及黏附分子ICAM-1的分泌,促进活性氮NO的生成,由此可见,在动脉粥样硬化的进程中,SAP可促进炎症免疫、氧化应激反应,在动脉粥样硬化的发生发展中有着重要作用,但具体调节机制仍需要更进一步的研究证明。第二部分普罗布考对冠心病病人PCI术后再狭窄影响的系统回顾和meta分析研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease, CHD)一直是当今世界发病率乃至死亡率最高的疾病之一,作为人类的头号杀手,冠心病的预防与治疗一直是困扰着我们的重大难题。近些年经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)已经逐渐成为冠心病尤其是有冠状动脉严重狭窄病人的首选内科治疗方案,无论是球囊扩张术还是支架置入术都可以在短时间内开放狭窄血管、恢复心脏供血、减少心肌细胞坏死,对病人症状的缓解和预后都有较大的获益。然而,有一个问题严重影响了PCI的远期治疗效果,那就是PCI术后的血管内再狭窄,不管是血管形成术(30%-50%)还是支架内置入(15%-20%)都有较高的血管内再狭窄率,而如何减少再狭窄率则是亟待解决的临床问题。普罗布考是一个历史悠久的调脂药物,能够明显降低总胆固醇(total和低密度脂蛋白胆固醇cholesterol, TC)且对家族性高胆固醇血症(FH)患者的黄色瘤有独特的降解作用,(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C),而普罗布考最开始却作为一种工业抗氧剂而为人们所认识,有着强烈的抗氧化作用,能够保护正常细胞不受氧化应激损伤,氧化应激损伤也是发生PCI术后再狭窄的一大原因之一,对于普罗布考对PCI再狭窄的作用也有多项研究来探讨验证,但是多项研究的结果却不尽一致,因此,本部分研究致在探讨普罗布考PCI术后血管内再狭窄的具体作用以及可能的机制。研究方法两名研究者通过在线检索和PubMed, EMBASE, ScienceDirect图Cochrane书馆等数据库,并且手工检索会议、书籍论文和相关论文的参考文献等,通过摘要初筛出与普罗布考及冠心病、PCI术后再狭窄等相关的随机对照研究,再通过仔细阅读全文,确定纳入文献,分组：实验组为规律服用普罗布考并行PCI的冠心病患者,对照组则为除了常规药物治疗,未服用任何调脂药的行PCI的冠心病患者,随访期大于3个月,并在随访结束时再次行冠状动脉造影检查,检查球囊扩张或支架置入处管腔狭窄程度,综合两次造影结果,评价两组间管腔再狭窄率、最小管腔内径晚期丢失(minimal luminal diameter, MLD)、和随访期间主要心血管事件(late loss)发生率,(major adverse cardiac events, MACEs)并结合亚组分析、敏感性分析、漏斗图等评价结果稳定性和有无选择偏倚等,用RevMan 5.2进行文献质量评价以及结果分析。研究结果1.在线和手动检索了327篇文献,初筛后有37篇相关文章,仔细阅读全文后,纳入10篇随机对照研究,共859人；2.数据分析发现,对于主要指标再狭窄率来说,无论是病人再狭窄率(RR=0.52[0.40,0.68],P0.00001)还是血管内再狭窄率((RR=0.59[0.43,0.80],P=0.0007),普罗布考组相较于对照组,再狭窄率均明显减少,而次要指标中,普罗布考组的MLD较对照组有明显增加(SMD= 0.45 [0.30,0.61], P＜0.00001),晚期丢失则有所下降(SMD=-0.41 [-0.60,-0.22], P＜0.0001),而临床上最关心的指标MACEs,普罗布考组的MACEs发生率较对照组明显下降(RR=0.69[0.51,0.93],P=0.01)；3.异质性分析发现,指标MLD的异质性略高(P=0.01,I2=42%),亚组分析结果发现,行血管形成术和支架置入术患者MLD有一定差异(P=0.05),这可能是MLD异质性的来源；4.敏感性分析可证实验结果较为稳定,漏斗图发现纳入文献并无发表偏倚。研究结论：普罗布考能够明显降低冠心病病人PCI术后患者血管再狭窄率和晚期血管丢失,增加血管最小管腔内径,并且可以减少临床主要心血管事件的发生。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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