热休克蛋白65对T细胞中蛋白酪氨酸激酶Lck的活性及逆胆固醇转运的影响及其机制研究

发布时间：2017-11-22 02:29

  本文关键词：热休克蛋白65对T细胞中蛋白酪氨酸激酶Lck的活性及逆胆固醇转运的影响及其机制研究

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【摘要】：研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一个以血管内皮细胞损伤、血脂代谢异常为基础、以血管慢性炎症为特征的病理过程,可引发心肌梗死、脑梗死等严重危害人类健康和生命的疾病。近年来研究表明高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol, HDL)功能较血浆HDL-C水平更能准确反映AS及冠心病发生风险,并且已有研究证实冠心病患者中HDL为失功能HDL,具有促AS作用。HDL是一个复杂的多功能蛋白复合体,可通过其促进胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport, RCT)、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、增强内皮功能、改善糖尿病的血糖控制情况以及抑制造血干细胞增殖等多种功能发挥抗AS作用。巨噬细胞胆固醇流出率可独立于HDL-C水平更好地预测AS及冠心病发生风险,可作为评估HDL功能的一个金指标。2014年发表在新英格兰杂志的人群队列研究中表明：胆固醇流出率作为代表逆胆固醇转运的新的生物标志物,与心血管事件发生呈负相关。AS病灶内存在着大量的免疫活性细胞—T淋巴细胞,这些免疫细胞激活后会释放活性酶、细胞因子等,从而诱导血管壁炎症反应。研究发现,随着AS进展,T淋巴细胞和巨噬细胞、平滑肌细胞一样增殖,在AS损伤及斑块中的含量增加。热休克蛋白65(heat shock protein65, HSP65)作为分枝杆菌主要抗原之一,具有很强的免疫原性,而且在感染机体时高度表达,并被免疫系统识别。大量研究发现,菌源HSP65含有多重T细胞表位,可以和自身HSP65发生交叉免疫反应,引发强烈的细胞免疫。此外,AS斑块中的T淋巴细胞也可以识别HSP65,并发生免疫反应,使辅助性T细胞功能失衡,而活化的T淋巴细胞作为效应细胞可分泌趋化因子聚集肥大细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞,也可决定B细胞和单核细胞的分化和功能,促进AS的发生发展。淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, Lck)是一种在T细胞中表达的Src家族的细胞质酪氨酸激酶,在T细胞活化过程中起关键作用。T细胞活化之前,Lck首先通过N-末端的胱氨酸与CD4和CD8复合受体形成非共价键。T细胞和抗原呈递细胞的相互作用会导致Lck活化,随之可引起磷脂酶Cγ1(phospholipase C, PLCγ1)的酪氨酸磷酸化而活化后,即可裂解胞膜的磷脂而产生1,4,5-三磷酸肌醇(insositol 1,4,5-trisphosphate, IP3)和1,2-二酰基甘油(diacylgycerol, DAG),进一步通过IP3—Ca2+及DAG—蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)这两个重要的信号转导环节,经核转录因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)引起T细胞活化。其中,PKC激活及游离钙升高在AS发生、发展过程中有及其重要的作用。另外,Lck还可激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinases, MAPK)家族信号转导通路,通过其下游的AP-1、Fos、c-Jun分子发挥作用。有关HDL拮抗动脉粥样硬化的机制,研究较多的是它的促胆固醇逆转运、抗炎和抗氧化功能。另一方面,近些年来越来越多的资料证实,免疫细胞可反过来直接影响HDL介导的脂质代谢。T细胞激活后可通过氧甾酮代谢酶、淋巴毒素、MAPK家族成员等通路抑制胆固醇转运蛋白的表达,使细胞胆固醇转出率降低。因此,结合国内外研究表明：免疫炎症反应可影响淋巴细胞胆固醇转运蛋白及胆固醇流出率；我们的前期研究也表明：HSP65介导的免疫反应可通过损害HDL功能及抑制胆固醇流出而促进AS的发生发展。但HSP65是否对T细胞的脂质代谢有影响,是否通过调控Lck及其下游信号通路而影响逆胆固醇转运过程还未得到证实。研究目的本研究在人T淋巴细胞(Jurkat细胞)水平评估不同剂量HSP65对细胞免疫活化及逆胆固醇转运的影响,同时运用慢病毒shRNA-Lck基因沉默探索HSP65作用的下游基因及其功能表达,明确HSP65影响T细胞逆胆固醇转运的作用机制。研究方法1、不同浓度HSP65对细胞增殖能力、Lck蛋白活化及炎症因子分泌的影响：实验分组：1)正常对照组,2)HSP65 0.25μg/ml组,3) HSP65 0.5μg/ml组,4) HSP65 0.75μg/ml组,5) HSP65 1μg/ml组；采用CCK-8检测细胞在450nm处的吸光度,ELISA检测细胞上清中细胞因于IFN-γ、IL-10的浓度,Western blot检测酪氨酸激酶Lck蛋白表达情况。2、HSP65对细胞胆固醇流出率、胆固醇转运相关蛋白及mRNA表达的影响：实验分组：1)正常对照组,2) HSP65 0.25μg/ml组,3) HSP65 0.5μg/ml组,4) HSP65 0.75μg/ml组,5) HSP65 1μg/ml组；通过放射性同位素标记法来检测各组样品的胆固醇流出率；提取细胞蛋白,Western blot检测胆固醇转运相关蛋白表达情况；RT-PCR检测五个胆固醇相关转运子ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ、LXR-αmRNA表达水平。3、慢病毒shRNA-Lck转染Jurkat细胞后Lck在基因及蛋白水平的改变：实验分组：1)正常对照组(Jurkat),2)阴性对照组(NC),3) shRNA-Lck干扰组1(LV1),4) shRNA-Lck干扰组2(LV2)；将含有不同靶序列的基因片段以慢病毒为载体进行包装与滴度测定后干扰细胞。通过筛选出细胞最佳MOI(50)及感染条件：按照配制好的各组病毒稀释液,加入各组孔中,200u1/孔；加入配制好的Polybrene稀释液100u1/孔,使得孔内终体积为1ml,Polybrene作用终浓度为5ug/ml;培养8h后,更换培养液,分别于转染操作12h、24h、48h、72h后于荧光倒置显微镜下观察细胞生长状况,72h时使用流式细胞仪测GFP荧光细胞转染效率。之后,收集各组细胞,通过real time-PCR和Western blot检测酪氨酸激酶Lck在基因及蛋白水平的表达情况。4、慢病毒shRNA-Lck转染Jurkat细胞对Lck下游信号通路及逆胆固醇转运功能的影响：实验分组：1)正常对照组(Jurkat),2)阴性对照组(NC),3) shRNA-Lck干扰组1(LV1),4) shRNA-Lck干扰组2(LV2)；通过Fluo-3/AM激光共聚焦扫描法检测细胞内钙离子浓度；[3H]放射性同位素标记检测各组样品的胆固醇流出率；油红O染色检测细胞内脂滴含量；高效液相色谱法检测细胞内胆固醇酯含量。5、慢病毒shRNA-Lck转染Jurkat细胞对Lck下游信号通路蛋白及胆固醇转运蛋白的影响：实验分组：1)正常对照组(Jurkat),2)阴性对照组(NC,3) shRNA-Lck干扰组1(LV1),4) shRNA-Lck干扰组2(LV2)；通过Western blot检测Lck下游通路蛋白ERK1/2、JNK通路磷酸化,PKC-γ及NF-κB蛋白水平；检测胆固醇转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α表达情况。6、shRNA-Lck转染对1μg/ml HSP65诱导下Jurkat细胞的Lck下游信号通路及逆胆固醇转运的影响：实验分组：1)1μg/ml HSP65组,2)NC+1μg/ml HSP65组,3)LV1+1μg/ml HSP65组,4) LV2+1μg/ml HSP65组；通过Fluo-3/AM激光共聚焦扫描检测细胞内钙离子浓度,Western blot检测Lck下游通路蛋白表达情况(ERK1/2、JNK蛋白磷酸化,PKC-γ及NF-κB蛋白表达水平)；[3H]放射性同位素标记检测各组样品的胆固醇流出率；Western blot检测脂质转运相关蛋白表达情况；油红O染色检测细胞内脂滴含量；高效液相色谱法检测细胞内胆固醇酯含量。7、统计学处理所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS13.0统计软件进行两样本均数比较的独立样本t检验分析,多组间总体均数比较,在方差齐时采用单向方差分析(one-way ANOVA),方差不齐时采用Welch校正检验。多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett's T3检验,P0.05为差异有统计学意义。研究结果1、HSP65可促进Jurkat细胞增殖,活化Lck蛋白表达,使IFN-γ分泌增加、IL-10分泌减少,在本实验的浓度范围内呈浓度依赖性用不同浓度HSP65 (0、0.25、0.5、0.75、1μg/ml)刺激Jurkat细胞后,各组之间整体比较,不同组间细胞增殖能力呈显著性差异(F=90.513,P0.001)。与正常对照组相比,0.25μg/ml组、0.5μg/ml HSP65组、0.75μg/ml HSP65组和1μg/ml HSP65组在450nm处的吸光度均明显升高(P0.001),差异有统计学意义。不同组间Lck蛋白表达量随HSP65浓度梯度增高逐渐增强。与正常对照组(0.89±0.22)比较,0.75μg/ml HSP65组Lck蛋白表达量(1.69±0.16)升高,差异有统计学意义(P0.05),1μg/ml HSP65组Lck蛋白表达量(1.90±0.83)显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。不同浓度HSP65可以使促炎因子IFN-γ分泌增加,抑炎因子IL-10分泌减少。不同浓度HSP65对Jurkat细胞上清中IFN-γ的分泌作用与正常对照组(15.59±0.86)相比均具有显著统计学差异(P0.001)。与0.25μg/ml组(17.58±0.89)相比,0.5μg/ml HSP65组(18.76±1.08)升高,差异有统计学差异(P0.05)；与0.75μg/ml组相比,1μg/ml组(25.02±0.98)升高,差异有显著统计学意义(P0.001)。与正常对照组(21.86±0.92)相比,随着药物浓度的升高,HSP65对细胞上清中IL-10的作用逐渐减弱,结果均具有统计学差异(P0.05)。与0.25μg/ml组(19.89±1.249)相比,0.5μg/ml HSP65组(17.07±1.28)降低,差异有统计学差异(P=0.001)。通过此实验证明HSP65能活化增殖T细胞,促使T细胞分化(Th1/Th2)功能失衡,具有致AS作用。2、HSP65可抑制胆固醇流出率,下调胆固醇转运相关调节子(ABCA1、ABCG1、 SR-BI、PPAR-γ、LXR-α)蛋白及mRNA的表达将不同浓度的HSP65 (0、0.25、0.5、0.75、1μg/ml)刺激Jurkat细胞后,与正常对照组(21.27±2.44%)相比,不同HSP65浓度刺激组胆固醇流出率明显降低(胆固醇流出率分别为15.56±2.58%,14.36±1.42%,12.96±2.45%和10.69±2.03%)(P0.001),且在实验浓度范围内成剂量依赖性,具有显著性差异。与正常对照组比较,此实验中HSP65刺激效应在1μg/ml浓度时胆固醇流出率降低最为明显,故此后续实验均采用1μg/ml浓度进行细胞干预。上述实验结果已经证实HSP65对胆固醇转出功率的影响,因此在本实验中我们着重观察HSP65对胆固醇转运蛋白表达的调节机制：给予不同浓度HSP65处理细胞后,ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α五个蛋白各自组间差异显著(F=15.615,P0.001；F=18.069,P0.001；F=5.212,P0.05；F=8.426,P0.05；F=40.369,P0.001)。与正常对照组比较,HSP65可明显下调了ABCA1、 ABCG1、SR-BI、PPAR-γ及LXR-α五个转运蛋白的表达水平,且在实验浓度范围内呈剂量依赖效应,差异均具有统计学意义(P0.05)。与正常对照组比较,0.25μg/ml HSP65组ABCG1、PPAR-γ和LXR-α mRNA表达量均明显降低(P0.05),差异有统计学意义；而0.25μg/ml HSP65组ABCA1和SR-BI mRNA表达量与对照组相比较无明显差异(P0.05),差异无统计意义；与正常对照组比较,0.5μg/ml HSP65组ABCA1,ABCG1,SR-B1,PPAR-γ和LXR-α mRNA表达量均明显降低(P0.05),差异有统计意义。通过此实验发现了在此浓度范围内的HSP65能明显降低免疫细胞的胆固醇流出率,下调胆固醇转运蛋白及基因表达,但具体是通过哪些信号通路介导,是否与免疫活化反应有关,还需要进一步证实。3、慢病毒shRNA-Lck可明显沉默细胞的Lck基因表达,下调Lck蛋白表达上述实验证实HSP65作用于Jurkat细胞后,酪氨酸激酶Lck的蛋白表达量会随着浓度的增加而逐渐增强,说明HSP65刺激细胞能活化Lck,因此在本实验中,我们构建了两个不同靶序列基因片段,以慢病毒为载体(shRNA)来沉默Lck基因表达,旨在研究Lck是否介导HSP65引起的逆胆固醇转运功能改变及其作用机制。与阴性对照组比较,LV1组与LV2组Lck蛋白表达均降低(P0.05),差异有统计学意义。与上述结果相似,与阴性对照组比较,LV1组与LV2组Lck mRNA表达量均明显降低(P0.001),差异有显著统计学意义。4、慢病毒shRNA-Lck既可抑制细胞内钙离子含量,又可促进逆胆固醇转运过程与阴性对照组相比,LV1组细胞内钙离子浓度(99.91±7.75,P0.001)显著降低,差异有统计学意义,LV2组细胞内钙离子浓度(108.15±11.75,P0.001)降低,差异有统计学意义。为了明确Lck是否参与免疫细胞的逆胆固醇转运过程,我们对采用shRNA-Lck基因沉默后的细胞检测胆固醇转出率。与阴性对照组(19.08±0.63%)比较,LV1组胆固醇流出率明显升高(23.46-±1.53%,P0.001),LV2组胆固醇流出率明显升高(25.27±2.01%,P0.001),均具有显著性差异。作为评价细胞胆固醇转出率的间接指标,我们检测了细胞内脂滴及胆固醇酯含量。通过油红O染色测定细胞胞浆内脂滴含量,经Image J软件相对定量(总脂滴含量/细胞体积)后结果：与阴性对照组(0.15±0.01%)比较,LV1组细胞内脂滴含量(0.09±0.02%,P0.05),差异不具有统计学意义；LV2组细胞内脂滴含量明显降低(0.07±0.05%,P0.05),具有显著性差异。通过高效液相色谱法测定细胞内胆固醇酯含量/细胞内总胆固醇含量,结果显示：与阴性对照组(0.50±0.02)相比,LV1组(0.30±0.04)与LV2组(0.32±0.02)细胞内胆固醇酯相对含量均降低,差异有统计学意义(P0.05)。以上实验结果提示：Lck在T细胞逆胆固醇转运中发挥着重要作用。5、shRNA-Lck可下调Lck下游通路蛋白的表达,上调胆固醇转运相关蛋白的表达上一步的实验结果已经证实Lck对细胞免疫通路及逆胆固醇转运通路均存在影响,因此在本实验中我们着重观察Lck具体是通过下游哪些通路蛋白对胆固醇转运蛋白进行调节。我们分别将两段带有Lck干扰片段的慢病毒载体转染细胞72h后,分别提取各组蛋白,检测DAG下游蛋白PKC-γ表达,MAPK家族成员ERK1/2、JNK磷酸化水平,及核转录因子NF-κB活性。结果显示：两个靶序列的RNA干扰片段均明显下调了ERK1/2、JNK、PKC-γ和NF-κB四个蛋白的表达水平。与阴性对照组相比,LV1组与LV2组PKC-γ蛋白表达含量降低,差异均有统计学差异(P0.05)；ERK1/2和.JNK磷酸化水平、NF-κB三个蛋白各自组间差异显著(F=24.248,P0.001；F=69.837,P0.001；F=20.62,P0.001)。与阴性对照组比较,LV1组ABCA1和ABCG1蛋白表达量明显升高(P0.05),均具有显著性差异,而SR-BI、PPAR-γ和LXR-α组间比较无明显差异(P0.05)无统计学意义；LV2组ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量明显升高(P0.05),具有显著性差异。综上实验结果及国外研究提示：Lck可能通过下游ERK1/2、JNK、NF-κB等信号蛋白通路,抑制胆固醇相关转运蛋白,从而下调逆胆固醇转运功能。6、HSP65通过Lck及其下游信号蛋白发挥抑制逆胆固醇转运功能为了进一步观察上一部分实验结果讨论的Lck及其下游信号通路是否参与HSP65促进细胞免疫活化的效应,我们在Lck基因沉默后,给予1μg/ml HSP65刺激24小时。与NC+1μg/ml HSP65组(240.47±13.63)相比,LV1+1μg/ml HSP65组(128.86±10.26)与LV2+1μg/ml HSP65组(127.20±13.19)细胞内钙离子浓度均显著降低,差异有统计学意义(P0.001)。与NC+1μg/ml HSP65组相比,LV1+1μg/ml HSP65组与LV2+1μg/ml HSP65组PKC-γ蛋白表达含量、ERK1/2和JNK磷酸化水平及NF-κB四个蛋白各自组间差异显著(P0.05；P0.05；P0.001；P0.001)。以上研究表明：HSP65介导的T细胞免疫活化反应是由Lck及其下游信号通路介导。为进一步观察Lck及其下游信号通路是否参与HSP65抑制细胞中逆胆固醇转运的效应,我们在Lck基因沉默后,给予1μg/ml HSP65刺激24小时。与NC+1μg/ml HSP65组(10.83±1.23%)比较,LV1+1μg/ml HSP65组(17.89±2.39%)及LV2+1μg/ml HSP65组(17.76±1.33%)胆固醇流出率均明显升高(P0.001),具有显著的统计学差异。通过油红O染色测细胞内脂滴含量,发现：与NC+1μg/ml HSP65组(0.22±0.04%)比较,LV1+1μg/ml HSP65组(0.11±0.05%)细胞胞浆内脂滴含量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),LV2+1μg/ml HSP65组(0.12±0.04%)细胞内脂滴含量降低,具有显著性差异(P0.05)。通过高效液相色谱法测定细胞内胆固醇酯含量/细胞内总胆固醇含量,结果显示：与NC+1μg/ml HSP65组(0.66±0.01)相比,LV1+1μg/ml HSP65组(0.40±0.03)与LV2+1μg/ml HSP65组(0.41±0.01)细胞内胆固醇酯相对含量均降低,差异有统计学意义(P0.05)。与NC+1μg/ml HSP65组比较,LV1+1μg/ml HSP65组ABCA1、ABCG1、SR-BI、PPAR-γ和LXR-α蛋白表达量明显升高(P0.05),均具有统计学差异；LV2+1μg/ml HSP65组ABCA1和SR-BI蛋白表达量明显升高(P0.05),具有显著性差异,而ABCG1、PPAR-γ和LXR-α组间比较未见明显变化,差异不具有统计学意义(P0.05)。综上实验结果表明：HSP65能抑制RCT,Lck活性在此过程中起着重要作用。结论1.HSP65在浓度范围内(0-1μg/ml)可诱导T细胞增殖,活化蛋白酪氨酸激酶Lck,诱导促炎因子IFN-γ分泌,抑制抗炎因子IL-10分泌。2.HSP65诱导免疫炎症反应的同时损害了HDL的逆胆固醇转运功能,可降低T细胞胆固醇流出率,下调细胞ABCA1,ABCG1,SR-B1,PPAR-γ和LXR-α的表达,且随着HSP65剂量的增加,对逆胆固醇转运功能的影响愈加明显。3.构建的两段不同的Lck基因靶序列均能成功地在受感染细胞中表达,并能特异且高效抑制Lck蛋白的表达,从而下调其下游相关信号分子的表达。4.RNAi技术阻断Lck活化后,能增强逆胆固醇转运通道蛋白水平,提高细胞内胆固醇流出率,进而降低细胞内胆固醇酯含量。5.HSP65通过活化Lck既能促进TCR介导的免疫信号通路,又能抑制T细胞的逆胆固醇转运过程。6.通过本研究及以前资料我们得出总结论：HSP65通过Lck及其下游免疫信号通路抑制T细胞的逆胆固醇转运功能。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5

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本文编号：1213188