氧化低密度脂蛋白对巨噬细胞作用机制的实验研究

发布时间：2017-11-22 04:26

  本文关键词：氧化低密度脂蛋白对巨噬细胞作用机制的实验研究

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【摘要】：目的:通过体外分离氧化低密度脂蛋白(oxidised low density lipoprotein,oxLDL)及体外诱导THP-1人单核细胞系分化形成单核细胞来源巨噬细胞(monocytes derived macrophages,MDMs),结合细胞功能学实验和免疫学实验,探讨ox LDL对巨噬细胞增殖的相关作用和分泌巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MMIF/MIF)的作用,并通过使用NF-κB通路抑制剂以及使用逆转录病毒将shp65质粒稳定转染、敲低MDMs细胞内的p65蛋白表达,以此验证NF-κB通路在MDMs分泌MIF过程中的作用。体内实验通过采集临床上出现血管介入术后再狭窄患者的血清,以首次入院动脉粥样硬化闭塞症(artherosclerosis obliteran,ASO)患者及健康志愿者血清作为对照,分别检测各组MIF水平,旨在观察MIF在再狭窄患者体内是否明显升高,从而为之后进一步研究MIF是否为介入术后再狭窄发生的风险因素提供了理论基础。方法:1.体外研究:(1)佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)成功诱导THP-1分化形成MDMs,经油红O染色证实为巨噬细胞后用于实验。(2)两步法超高速离心人血清,获得密度为1.019-1.063g/ml的低密度脂蛋白,再经紫外灯照射(254nm,0.5mW/cm2,2h)制备得到oxLDL,过滤消毒后用于实验。(3)MDMs分别与25μg/m、50μg/ml和75μg/ml浓度oxLDL培养12h、24h及48h后,CCK-8法检测细胞增殖,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定各组上清的MIF浓度;以不加入oxLDL培养组为正常对照(normal control,NC)。(4)同法诱导含稳转NF-κB-Luc质粒的THP-1细胞分化形成NF-κB-Luc-MDMs,同上ox LDL浓度梯度培养后,荧光素酶底物(Luciferase)法通过化学发光仪检测各组上清在加入底物后产生的荧光强度,以反映各组细胞NF-κB通路的激活情况。(5)在MDMs中分别加入终浓度为0和10μM的NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082,同法培养并检测各组上清中的MIF浓度。(6)利用逆转录病毒稳定转染shp65以敲低THP-1细胞内NF-κB通路活性,同法诱导后检测各浓度梯度ox LDL对shp65-MDMs分泌MIF的影响。t检验进行组间比较,P0.05为差异有统计学意义。2.再狭窄患者血清中MIF水平的检测:(1)患者入选标准的制订,采集无动脉粥样硬化病变正常志愿者、首次入院ASO患者和ASO介入术后再狭窄动脉患者外周血。实验组及对照组各组的患者血清样本的采集及预处理。(2)ELISA检测各组血清中的MIF浓度。(3)与各对照组MIF水平对比,统计分析各组外周血MIF水平差异。结果:1.体外研究:(1)与NC组相比,25μg/ml、50μg/ml及75μg/ml oxLDL组12h时MDMs增殖显著升高,48h时分别达到17.7%、27.8%和41.2%(P0.001);其上清液MIF也在12h起升高,48h时分别是NC组的1.49、1.67和2.09倍(P0.001)。(2)与NC组相比,oxLDL各组在12h即可检测到NF-κB通路明显激活,24h时MDMs内NF-κB通路活性分别增加38.1%、60.3%和61.1%(P0.001)。(3)加入BAY11-7082后,各组上清液MIF浓度在12h即出现明显下降,48h时分别下降58.6%、69.3%、69.7%和73.5%(P0.001)。(4)shp65-MDMs的MIF分泌水平与对照组相比,各浓度组于12h即出现明显下降,48h时分别下降42.6%、48.3%、40.7%和33.5%(P0.001)。2.再狭窄患者血清中MIF水平的检测:相较于正常对照组,首次入院动脉粥样硬化闭塞症患者术前并无明显MIF水平升高(p0.05),而发生介入术后再狭窄的患者入院时可见血清MIF水平的明显升高(p0.05)。结论:(1)oxLDL可促进MDMs的增殖能力。(2)oxLDL可促使MDMs合成分泌MIF,此过程涉及NF-κB信号通路,采用NF-κB抑制剂或敲低细胞内p65蛋白表达可抑制MIF的分泌。(3)与正常人、未发生再狭窄患者血清MIF水平相比较,介入治疗术后再狭窄患者的外周血MIF水平升高。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543

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本文编号：1213495