以RUNX3为靶点干预低氧诱导人心脏微血管内皮细胞间质转分化

发布时间：2017-12-15 23:13

  本文关键词：以RUNX3为靶点干预低氧诱导人心脏微血管内皮细胞间质转分化

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【摘要】：目的:1、研究低氧对人心脏微血管内皮细胞(HCMECs)间质转分化的影响;2、HCMECs间质转分化过程中TGF-β信号通路及Notch信号通路的变化;3、RUNX3敲减对HCMECs的功能及间质转分化的影响及具体机制。方法:1、研究低氧对HCMECs间质转分化的影响。实验分组Normoxia组:常氧(21%O2、5%CO2、74%N2,37℃)条件下培养HCMECs;Hypoxia组:低氧(1%O2、5%CO2、94%N2,37℃)培养HCMECs,两组细胞分别于培养1天、4天、5天(用H1、H4、H5表示)。进行如下实验:⑴光学显微镜下观察各组细胞形态学变化;⑵免疫荧光双标染色,在荧光显微镜下观察CD31、αSMA强度变化及CD31+/αSMA+双阳性细胞(代表正在发生间质转分化的内皮细胞),并计数分析;⑶RT-PCR法测定各组细胞中CD31、VE-cadherin、αSMA及FSP-1m RNA含量并比较。2、研究低氧诱导HCMECs间质转分化过程中TGF-β及Notch信号通路的变化,RUNX3敲减对HCMECs的功能及间质转分化的影响。实验分组Control组:常氧条件下培养HCMECs。Hypoxia组:低氧条件下培养HCMECs 4天。RUNX3组:常氧条件下培养HCMECs,铺板过夜后转染RUNX3-RNAi慢病毒,低氧培养4天。GFP组:常氧条件下培养HCMECs,铺板过夜后转染空载体慢病毒,低氧培养4天。各组细胞进行如下实验:⑴免疫荧光双标染色,在荧光显微镜下观察CD31、αSMA强度变化及CD31+/αSMA+双阳性细胞(代表正在发生间质转分化的内皮细胞),并计数分析;⑵应用Transwell迁移实验对各组HCMECs迁移能力进行检测;⑶应用小管形成实验对各组HCMECs血管新生能力进行检测并比较;⑷RT-PCR法测定各组细胞中CD31、VE-Cadherin、αSMA、FSP-1、RUNX3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Notch-1、Hes1、Hey1、Slug、Snail的m RNA含量并比较;⑸Western blot法测定各组细胞中CD31、VE-Cadherin、αSMA、FSP-1、RUNX3、Notch-1、Hes1、Hey1、Slug、Snail、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白含量并比较。结果:1、低氧对HCMECs间质转分化的影响:⑴光学显微镜可见:与Normoxia组比较,Hypoxia组HCMECs细胞逐渐出现形态学变化,失去了铺路石样或鹅卵石样结构,逐渐呈长梭形或纺锤形生长。⑵免疫双标荧光染色结果显示:随着低氧时间延长,Hypoxia组HCMECs中CD31强度逐渐减弱,αSMA强度逐渐增强,其中H4组CD31+/αSMA+双阳性细胞最多(P0.01)。⑶RT-PCR结果显示:Hypoxia组HCMECs中CD31、VE-cadherin的m RNA表达降低,αSMA、FSP-1的m RNA表达升高(P0.05)。2、敲减RUNX3基因对HCMECs间质转分化的影响:⑴免疫双标荧光染色结果显示:与GFP组相比,RUNX3组HCMECs中的CD31强度增强,αSMA强度减弱。⑵RT-PCR及Western Blot结果显示:与Hypoxia组相比,RUNX3组细胞的CD31、VE-Cadherin的m RNA及蛋白表达上调而αSMA、FSP-1 m RNA及蛋白表达下调(P0.05)。3、敲减RUNX3基因对HCMECs功能的影响:⑴小管形成实验结果显示:低氧促进HCMECs血管成型,而RUNX3敲减后进一步促进血管成型(P0.05)。⑵Transwell迁移实验结果显示:低氧促进HCMECs迁移,RUNX3敲减后部分抑制了HCMECs迁移能力(P0.05)。4、HCMECs间质转分化过程中TGF-β信号通路的变化:⑴RT-PCR结果显示:低氧激活了TGF-β信号通路,Hypoxia组的TGF-β1、Smad2、Smad3的m RNA表达水平均增高,差异有统计学意义(P0.05)。RUNX3敲减后TGF-β1m RNA表达水平进一步增高,而Smad2、Smad3的m RNA表达水平均下调,差异有统计学意义(P0.05)。⑵Western Blot检测显示:低氧促进Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达(P0.05);RUNX3敲减后是Smad2/3、P-smad2/3蛋白表达均下调(P0.05),且p-Smad2/3下降比例更大(P0.05)。5、HCMECs间质转分化过程中Notch信号通路的变化:RT-PCR及Western Blot检测结果显示:低氧同时激活了Notch信号通路,Hypoxia组的Notch-1、Slug、Snail、Hes1、Hey1 m RNA及蛋白的表达上调,差异有统计学意义(P0.05)。RUNX3敲减后Notch-1上调更明显,内皮间质转分化主要转录因子Slug、Snail均不同程度下调,同时Hes1、Hey1的表达水平明显下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1、低氧能诱导HCMECs发生间质转分化,同时促进血管新生及细胞迁移;2、TGF-β信号通路及Notch信号通路均上调,提示两信号通路在低氧诱导HCMECs间质转分化过程中起重要作用;3、RUNX3低表达减轻低氧诱导HCMECs间质转分化,RUNX3低表达部分抑制了TGF-β信号通路及Notch信号通路,RUNX3可能为TGF-β信号通路及Notch信号通路下游的共同靶点。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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本文编号：1293776