核因子-κB途径介导硫酸吲哚酚抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞B类1型清道夫受体的表达

发布时间：2017-12-30 10:37

本文关键词：核因子-κB途径介导硫酸吲哚酚抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞B类1型清道夫受体的表达　出处：《南方医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、背景研究人员逐渐认识到,慢性肾脏疾病(chronic kidney disease, CKD)是心血管疾病患者不良预后的独立危险因素,而心血管疾病也是慢性肾脏疾病的主要死亡原因之一。尽管近年来心血管疾病的病理生理和治疗技术取得了很大进步,慢性肾脏疾病仍然是全球性健康问题。即使在接受血液透析的情况下,肾衰竭患者心血管事件仍在增加,而心肾综合征的机制至今仍不清楚。研究显示,冠心病高发于慢性肾脏疾病人,透析患者心血管相关死亡是普通人群的十到30倍,慢性肾脏疾病进展期的心血管疾病发病率及死亡率高于终末期肾脏疾病。在CKD人群中,心力衰竭(heart failure, HF)是最常见的临床症状,而代偿性尿毒症性心肌病,如左室肥厚,则是心血管死亡的预测因素。即使在轻至中度的CKD中,肾小球滤过率仍与心血管事件的发生及死亡负相关。CKD患者存在多种尿毒症毒素,不仅加重了肾脏疾病的损害,在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。动脉粥样硬化是心血管疾病重要基础,可见只要控制甚至预防它的发病可以延长慢性肾脏疾病患者的寿命和提高其生活质量。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的机制十分复杂,是多种因素共同作用的一个长期演变过程[13]。动脉粥样硬化尤其是高胆固醇血症的AS,其可能机制是单核／巨噬细胞与损伤血管内皮细胞黏附,迁入内皮细胞下,并开始吞噬脂质,转化为巨噬泡沫细胞。胆固醇不能在巨噬泡沫细胞内经氧化还原后排出,巨噬泡沫细胞排出胆固醇主要依赖自由扩散和B类1型清道夫受体(SR-B1)等参与的逆转运。已有研究证实,SR-B1是HDL中胆固醇及胆固醇酯转运的重要受体,参与体内胆固醇逆向转运过程,发挥抗动脉粥样硬化的作用。而核因子NF-κB信号是SR-B1 mRNA转录过程重要的调节因子,抑制SR-B1 mRNA的表达。硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)是蓄积于尿毒症患者体内最丰富的吲哚类化合物,属蛋白结合类毒素,主要经肾脏有机阴离子转运系统(OAT)排泄。尿毒症患者由于肾功能衰竭,不能将其有效地排出而蓄积于体内,产生一系列病理变化。研究证实,硫酸吲哚酚与动脉粥样硬化的发生发展密切相关,具体机制不明确。但有实验发现IS可激活NF-κB,作为细胞因子激活的始动因子,进而诱导肾间质纤维化。据以上分析,本文通过研究IS对THP-1源性巨噬泡沫细胞SR-B1表达的影响以及在NF-κB信号转导中的可能作用,探讨尿毒症毒素IS在动脉粥样硬化的作用及机制。二、目的观察尿毒症毒素硫酸吲哚酚(IS)是否促进巨噬泡沫细胞脂滴的蓄积,以及对细胞内B类1型清道夫受体(SR-B1)表达和核因子NF-κB活化的影响。三、方法THP-1人单核细胞进行培养和传代是按照美国标准生物品收藏中心(ATCC)的说明进行的,将THP-1细胞置于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,于37℃、5%CO2细胞培养箱中静置培养。细胞复苏后,于含160n mol/LPMA无血清的RMMI-1640培养基中培养48h,使THP.1单核细胞分化为巨噬细胞。弃掉上述巨噬细胞培养基,与5Omg/L ox-LDL,共同孵育48h,使之转发为泡沫细胞,油红O染色鉴定细胞。巨噬泡沫细胞分化培养成功后,加入无血清的RPMI1640培养基,1h后加入IS干预,使IS的终浓度分别为0、2.5、25、250μmol/L。取细胞,Trizol法提取出总RNA,并检测其完整性。根据RT-PCR试剂盒进行逆转录及PCR反应。引物设计：SR-B1的上游引物：5’-GGAACTTCTGGGCAAATGTG-3',下游引物：5-CTTCGTTGGGTGGGTAGATG-3',扩增片段为112bp；反应体系为201μL,反应条件为：50℃2min,95℃30s,95℃5s,60℃34s,40个循环。取扩增产物5ul与上述缓液混合混合进行2%琼脂凝胶电泳,并与标准分子量比较,鉴定扩增产物。取各组细胞,按照试剂盒说明书提取总蛋白。BCA法测量蛋白浓度。将提取的蛋白溶液与5x上样buffer按5：1比例混合均匀,配置电泳胶,进行电泳分离、转膜、4℃封闭孵育过夜,次日加一抗37℃孵育2h,TBST和蒸馏水漂洗后加二抗37℃孵育1h,再次TBST和蒸馏水漂洗后将杂交膜置于透明塑料板上,将化学荧光发光底物均匀加到膜表面反应5 min后将膜放至暗盒进行显影。使用Labworks分析系统计算各蛋白条平均光度和面积灰度值,进行相对定量分析。为进一步检测IS刺激THP-1源性巨噬泡沫细胞导致SR-B1 mRNA抑制的可能信号通路,本实验对SR-B1 mRNA转录过程中有重要影响的核转录因子NF-κB蛋白水平进行检测。干预方法同前,样品准备：贴壁培养细胞,吸走细胞的所有培养基,用PBS大致清洗,向培养在96孔板的细胞每孔加100μL新鲜配制的1x裂解缓冲液溶解细胞,在室温情况下震荡(3000 rpm)细胞10分钟。使用NF-κB ELISA试剂盒检测裂解液中NF-κB蛋白水平,测量450nm处的各样本吸光光度值,用此表示NF-κB活化的程度。将细胞培养在6孔板,泡沫细胞成功诱导后,各组分别给予0、5、10、20、40μmol/L PDTC,预先孵育1h,再给予250 μmol/L的IS孵育3h,设加入等量PBS培养液的泡沫细胞设为空白对照组。摄取各组细胞总RNA后实时定量PCR检测S R-B1ml RNA的表达。以上实验均重复3次。检测的结果以X±S表示,用SPSS13.0软件行统计学分析,组间均数比较采用单因素方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。四、结果如已有文献记载,本实验中经PMA处理后,细胞呈梭形或不规则形贴壁生长,多数细胞出现伪足,分化为巨噬细胞,加入胆固醇和50mg/L ox-LDL共同培养24小时,油红O染色示细胞中形成大量的红色脂质颗粒,符合巨噬泡沫细胞的形态。与对照组(IS为Oμmol/L)比较,IS干预组细胞内脂滴明显增加,随着IS浓度的升高,细胞内脂滴逐渐增加。与对照组相比,细胞在不同浓度分组的IS(2.5 、25、250μmol/L)处理下,SR-B1 mRNA的表达下降(依次是1±0.14、0.44±0.04、0.14±0.02、0.06±0.01),随着IS浓度的增加,SR-B1蛋白逐渐减少,呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。取各组细胞的总蛋白进行western blotting检测。与对照组对比,经过不同浓度各组IS (2.5、25、 250μmol/L)处理后,SR-B1蛋白表达下降(SR-B1/β-actin依次为0.65、0.48、0.32、0.28),随IS浓度的升高,SR-B1蛋白的表达逐渐下降,呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。检测IS处理后各实验组泡沫细胞NF-κB活化程度,结果表明IS干预后巨噬泡沫细胞的NF-κB活化程度增高(依次是1.61±0.02、1.7±0.02、1.8±0.06、2.34±0.02),差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,浓度250μmol/L的IS处理下,实时定量PCR检测SR-B1 mRNA的表达,可见SR-B1 mRNA明显下降,下降达94%。在浓度为250μmol/L的IS组中,不同浓度(0、5、10、20、40μmol/L) PDTC预处理后SR-B1mRNA表达增加(依次是1±0.04、2.95±0.19、5.88±0.29、8.71±0.78、19.65±0.31),差异有统计学意义(P0.05)。五、结论心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是尿毒症的主要并发症之一,是慢性肾脏病(hronic kidney disease, CKD)的主要死亡原因。研究发现,CKD患者存在多种尿毒症毒素[13],不仅加重肾脏功能的损害,还促进CVD的发生、发展,硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)就是其中之一。IS是一种蛋白结合型小分子化合物,肾功能衰竭时在体内蓄积,成为一种尿毒症毒素。其对动脉粥样硬化形成的具体影响尚不清楚。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成的机制十分复杂,是多种因素共同作用的一个长期演变过程[14]。动脉粥样硬化尤其是高胆固醇血症的AS,其机制可能是单核/巨噬细胞与损伤血管内皮细胞黏附,迁入内皮细胞下,并开始吞噬脂质,转化为巨噬泡沫细胞[15]。胆固醇不能在巨噬泡沫细胞内经氧化还原后排出,巨噬泡沫细胞排出胆固醇主要依赖自由扩散和SR-B1等参与的逆转运[16]。已有研究证实,SR-B1是HDL中胆固醇及胆固醇酯转运的重要受体,参与体内胆固醇逆向转运过程,发挥抗AS的作用。本实验以THP.1源性巨噬细胞为研究对象发现,IS预处理后SR-B1 mRNA和蛋白表达水平均受到抑制,细胞内脂滴蓄积的数量增加,250μmol/L IS处理时SR-B1 mRNA表达下调达94%,表明IS促进泡沫细胞形成可能与SR-B1表达抑制有关。已有研究发现,NF-κB是IS促进CKD发生发展的分子机制之一[17],本实验IS处理时细胞NF-κB活化增加,250μmol/L IS处理时增加45.3%。NF-κB作为一种重要的核转录因子,它参与细胞内的信号传递,调控多种基因的表达,它的异常激活可促进肾纤维化[18]。纤维化是各种肾脏疾病进展至终末期常见的病理改变。而我们知道,CKD与AS同样关系密切[19]。据此,本实验发现,用NF-κB抑制剂PDTC预处理后,IS对SR-B1 mRNA表达的抑制得到了明显逆转,在40μmol/L处理时,SR-B1 mRNA表达恢复至94.3%,证实了NF-κB活化是IS抑制SR-B1 mRNA表达的信号通路之一。综上所述,Is抑制SR-B1的表达,增加THP-1源性巨噬泡沫细胞胆固醇的蓄积,促进巨噬细胞泡沫化,NF-κB活化是IS抑制SR-B1 mRNA表达的信号通路之一。新的发现将在动脉粥样硬化,特别是心血管疾病发生发展研究中提供理论依据。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692;R54

【共引文献】