ApoM通过抑制NF-κB活性下调TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1表达

发布时间：2018-01-15 22:18

  本文关键词：ApoM通过抑制NF-κB活性下调TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1表达　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 载脂蛋白M 细胞间粘附因子-1 血管细胞粘附因子-1 核因子-κB

【摘要】：背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是临床常见的慢性炎症性疾病,炎症和免疫反应是其重要的发病机制。高密度脂蛋白(high-density lipoproteins, HDL)是参与胆固醇逆向转运的关键脂蛋白,具有重要的抗AS作用。已有研究证实HDL在动脉硬化形成中还发挥重要的抗炎、抗氧化作用。载脂蛋白M (apolipoprotein M, apoM)是新近发现的一种与HDL功能和作用密切相关的载脂蛋白,这主要与apoM影响前β-HDL的形成有关。在成人,apoM主要表达在肝脏实质细胞和肾脏近端肾小管上皮细胞中。大量研究表明,apoM代谢异常与脂质代谢、糖尿病、冠心病及AS等疾病的发病机制有高度相关性。近年来,apoM在炎症疾病中的作用也受到了广泛的关注。已有研究表明,采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、酵母聚糖或松节油等刺激炎症小鼠模型后,小鼠的肝脏脏和肾脏中apoM的mRNA表达水平显著下降。另有研究表明,apoM的分泌和表达在细菌性感染和慢性HIV感染患者血清中均出现减少,提示apoM可作为一种急性时相反应蛋白。此外,研究人员还发现,apoM对异丙酚的抗炎作用起到促进作用,异丙酚可抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞中多种炎性因子的表达进而发挥抗炎作用,而apoM能以肝细胞核转录因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α, HNF-1α)依赖型方式加强此抗炎效应。近期的动物研究发现apoM能抑制LPS诱导的小鼠肝脏组织中细胞间粘附因子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和血管细胞粘附因子(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)的表达。这些研究说明apoM参与了炎症反应过程,但apoM参与调控炎症反应的机制目前尚不明确。核因子-κB (nuclear factor-icB, NF-κB)是一种多效性的核蛋白因子。它通过特异性结合于免疫球蛋白K轻链基因增强子区域的κB序列而具备广泛的生物学活性,如参与免疫炎症反应、平滑肌细胞增殖分化等。然而,NF-κB自身活化还可调节多种基因的表达,如诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和白介素-6 (Interleukin-6, IL-6),在动脉粥样硬化等多种慢性炎症反应过程中发挥关键调控作用。在经典的NF-κB炎性信号通路中,NF-κB以非活化状态与其抑制因子(inhibitor of NF-κB α)IκBα相结合形成复合物,感染、炎症等刺激因素能使IκBα发生磷酸化或降解,进而引起NF-κB活化并转运至胞核内,诱发炎症因子的转录激活及炎症损伤反应的发生。肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)是炎症反应过程中重要的致病成分,参与多种炎症性疾病的发生,细胞或组织在其刺激下可诱导ICAM-1和VCAM-1等表达。ICAM-1和VCAM-1作为重要的粘附因子,其异常表达和失调引起多种细胞聚集在炎症部位进而加重机体的免疫炎症反应。研究表明,TNF-α所引起的粘附分子表达增加与NF-κB炎性信号途径活化密切相关。然而,NF-κB在介导TNF-a所诱导的ICAM-1和VCAM-1表达的具体分子机制目前尚不明确,apoM是否通过影响NF-κB信号途径进而影响炎症因子表达还不清楚。为进一步探讨apoM的抗炎机制,本研究以肝癌细胞系HepG2细胞为研究对象,首先采用RT-PCR和Western Blot技术观察TNF-a处理细胞后,细胞中apoM, ICAM-1, VCAM-1和IκBα的表达变化,然后检测apoM对ICAM-1, VCAM-1和IκBα表达的影响,最后以siRNA-apoM和／或TNF-a分别作用于HepG2细胞,观察apoM对TNF-α诱导的细胞中ICAM-1, VCAM-1和IκBα表达以及NF-κB活性变化的影响,以进一步明确apoM在慢性炎症性疾病中发挥抗炎作用可能的分子机制。目的1).观察TNF-a对HepG2细胞中ICAM-1,VCAM-1,apoM及IκBα表达的影响；2).观察在HepG2细胞中,apoM对ICAM-1, VCAM-1以及IκBα表达的影响；3).观察在TNF-a处理的HepG2细胞中,apoM对ICAM-1和VCAM-1表达的影响是否通过调节NF-κB活性而实现。材料和方法1.主要材料TNF-a购自美国Sigma公司；实时荧光定量PCR检测试剂盒(SYBR(?) Premix Ex TaqTM II kit)和RNA逆转录试剂盒(PrimeScript(?) RT Reagent kit)均购自日本TaKaRa公司；TRIzol和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen 公司。2.细胞培养人肝癌细胞系HepG2细胞购自美国ATCC; HepG2细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素的DMEM完全培养基中,将细胞置于37-C、5% CO2饱和湿度环境中培养。3.RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR根据RNA提取试剂盒操作说明书用TRIzol (Invitrogen)等试剂提取培养细胞中的总RNA。然后将总RNA用逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录成cDNA。在ABI7500 FAST荧光定量PCR系统上,按照实时荧光定量PCR反应程序进行扩增。每个样本同时设置3个复孔,实验重复3次,所得数据以人GAPDH基因作为内参进行相对定量分析。反应达到设定阈值时的扩增循环数设为Ct,按照△△Ct方法计算目的基因mRNA的相对表达变化。4. Western Blot分析根据总蛋白提取试剂盒说明书提取HepG2细胞的总蛋白,采用Bradford法进行蛋白定量,以每个上样孔按照30μg计算上样体积。然后在制备的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,孵育一抗抗体：anti-β-actin,anti-appM,anti-ICAM-1, anti-VCAM-1和anti-IκBα抗体(Abcam),4℃孵育过夜,孵育后用辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG二抗抗体孵育,最后采用增强化学显色方法(ECL)进行曝光显影。5. siRNA-apoM转染apoM特异性小干扰片段(siRNA-apoM)购自广州锐博生物科技有限公司。转染前一天,将HepG2细胞按照适量细胞数接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养基的6孔板中,以次日细胞达30%-50%密度为宜。采用5gL脂质体Lipo2000转染培养细胞。置于37℃、5% CO2、饱和湿度的环境中培养48小时后,采用Western Blot技术检测目的基因蛋白表达情况。6.慢病毒载体转染构建带有GFP的慢病毒过表达载体LV-Mock和LV-apoM。将HepG2细胞按照适量细胞数接种到含有10%胎牛血清的DMEM培养基的6孔板中,以次日细胞达30%-50%密度为宜。置于37℃、5% C02、饱和湿度的培养箱中培养过夜。次日,以慢病毒感染HepG2细胞病毒感染指数(MOI)为20进行转染,将4μLPolybrene (8mg/mL)与稀释好的病毒液同时加入细胞中,轻轻摇匀,然后置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱。转染6-24小时更换新的培养基,转染后96小时收集细胞检测目的基因蛋白水平的表达。7. NF-κB活性检测在siRNA-apoM和TNF-α处理HepG2细胞后提取细胞核蛋白,对提取的蛋白采用Bradford法进行蛋白定量。将样本加入到孵育有双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)生物素的ELISA板,在酶标仪450nm波长处读取光密度值。根据标准曲线,计算NF-κB的含量。8.统计方法所有实验均独立重复3次,数据以x±s表示,独立样本比较采用t检验,各组间均数比较采用单因素方差分析,以SPSS 13.0统计软件完成,P0.05为差异有统计学意义。结果1. TNF-a下调HepG2细胞apoM及IκBα达,上调ICAM-1和VCAM-1表达TNF-α是一种重要的炎性介质,首先我们观察了TNF-α对HepG2细胞中apoM, IκBα, ICAM-1和VCAM-1表达的影响,我们以Ong/mL和lOng/mL的TNF-a分别处理HepG2细胞,采用RT-PCR和Western Blot技术检测各组细胞中apoM, IκBα, ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,]NF-α处理组HepG2细胞中apoM mRNA和蛋白表达水平以及IKBα蛋白表达水平显著下调,而ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P0.05)。2. ApoM对IKBa, ICAM-1和VCAM-1表达的影响ApoM是参与脂质代谢的重要载脂蛋白,但其在炎症反应中的作用机制目前尚不明确,为进一步研究其可能的分子机制,首先我们将构建的apoM慢病毒过表达载体(LV-apoM)和空载对照(LV-Mock)分别转染HepG2细胞,转染后采用Western Blot技术检测细胞中IκBα, ICAM-1和VCAM-1蛋白表达情况。Western Blot结果表明,LV-apoM转染后细胞中apoM表达升高9.9倍,差异具有统计学意义(P0.05)。说明慢病毒过表达载体转染成功。同时我们还发现,LV-apoM实验组细胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平分别显著下调了57.8%和52.8%,而IκBα蛋白水平则显著上调,差异具有统计学意义(P0.05)。3. ApoM通过抑制NF-κB活性下调TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1表达IKBα蛋白磷酸化和降解过程与NF-κB信号通路的活化密切相关。第二部分我们观察到过表达apoM可以引起IκBα蛋白水平显著上调。为进一步研究apoM是否影响TNF-a诱导的ICAM-1和VCAM-1表达及其可能的分子机制,本研究采用siRNA技术靶向沉默apoM,观察其对IKBa, ICAM-1和VCAM-1等因子表达的影响。将siRNA-apoM转染HepG2细胞,与对照组相比,siRNA-apoM组中apoM表达显著下调,差异具有统计学意义(.P0.05)。随之,在转染siRNA-apoM的HepG2细胞中继续加入Ong/mL或10ng/mL的TNF-α共孵育24小时,实验分组如下：(1)siRNA-NC+Ong/mL TNF-α (Control组)；(2)siRNA-apoM+Ong/mL TNF-α (siRNA-apoM组)；(3) siRNA-NC+10ng/mL TNF-α (TNF-α组)；(4) siRNA-apoM+10ng/mL TNF-α (siRNA-apoM+TNF-α组)。蛋白检测结果显示,与Control组相比较,siRNA-apoM组中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平分别上调了93.3%和110.6%,差异具有统计学意义(P0.05)。与TNF-α组相比较,siRNA-apoM+TNF-α组细胞内ICAM-1和VCAM-1蛋白水平则分别上调了200.8%和190.9%,差异具有统计学意义(P0.05)。同时,我们还发现siRNA-apoM处理能进一步增强TNF-α对IκBα的下调作用。提示apoM可能参与调控TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1表达,且该过程可能与NF-κB的活化密切相关。本研究进一步观察发现,与Control组比较,siRNA-apoM+TNF-α组细胞中NF-κB活性上调了475.4%,而TNF-组细胞则仅上调了160%,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1). TNF-α上调HepG2细胞中ICAM-1,VCAM-1表达水平,下调apoM及IκBα表达水平；2). ApoM下调HepG2细胞中ICAM-1, VCAM-1蛋白水平,上调IκBα蛋白表达水平；3). ApoM通过抑制NF-κB活性进而下调TNF-α诱导的HepG2细胞中ICAM-1和VCAM-1表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 杨简;杨俊;;细胞黏附分子和动脉粥样硬化[J];医学综述;2006年21期

，

本文编号：1430312