尼可地尔抑制大鼠颈动脉球囊拉伤后内膜增生及促进内皮化的研究

发布时间：2018-02-05 19:09

  本文关键词： 尼可地尔 血管球囊拉伤 K_ATP~+通道 εPKC通路 Akt通路　出处：《中国人民解放军医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：建立大鼠颈动脉球囊拉伤模型、糖尿病大鼠模型,并体外培养血管内皮细胞及血管平滑肌细胞,从动物-细胞-分子水平验证尼可地尔抑制大鼠颈动脉球囊拉伤后内膜增生并促进再内皮化的作用,为减少冠脉介入术后相关并发症提供新的理论依据。方法：腹腔注STZ建立糖尿病大鼠模型并行颈动脉球囊拉伤,分组：①假手术组(8只);②球囊拉伤组(10只);③尼可地尔组(10只);④尼可地尔-5HD共作用组(10只)。20只大鼠经血管外膜转染siRNA:NC siRNA组(10只);εPKC siRNA组(10只)。PCNA免疫组化染色分析细胞增殖；CD68免疫组化染色分析血管内炎性细胞浸润。培养原代VSMCs并分组：①对照组;②高糖组;③尼可地尔组;④尼可地尔-5-HD共处理组。VSMCs转染NC siRNA或εPKC siRNA,并检测细胞增殖与迁移。建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型,大鼠分为5组：①假手术组(10只);②球囊拉伤组(10只);③雷帕霉素组(20只);④雷帕霉素-尼可地尔共作用组(10只);⑤雷帕霉素-NAC共作用组(10只)。伊文思蓝染色及CD31免疫荧光染色检测血管再内皮化程度。DHE染色检测血管冰冻切片ROS水平。培养原代CMECs并分组：①对照组;②雷帕霉素组;③雷帕霉素-尼可地尔共处理组。于CMECs中转染XOsiRNA,Akt siRNA及NC siRNA。FCM检测Annexin V-FITC/PI染色细胞。酶标仪检测caspase 3活性。MTT法及BrdU试剂盒检测细胞增殖。划痕试验检测细胞迁移。FCM检测细胞内DHE荧光强度。Western blot检测血管中XO、εPKC蛋白及细胞水平XO、Akt、p-Akt、ePKC蛋白表达。qRT-PCR检测eNOS mRNA的表达。结果：糖尿病大鼠球囊损伤后14d新生内膜显著增生,尼可地尔组内膜增生减少,5-HD与尼可地尔共处理阻断了尼可地尔抑制内膜增生的作用。与球囊拉伤组糖尿病大鼠相比,尼可地尔组血管内膜中CD68、PCNA阳性细胞均减少。尼可地尔-5-HD共处理组大鼠血管新生内膜中PCNA、CD68阳性细胞较尼可地尔组增加。球囊拉伤组糖尿病大鼠颈动脉εPKC蛋白转位增加,尼可地尔抑制了εPKC蛋白转位,5-HD阻断了尼可地尔对颈动脉εPKC蛋白转位的抑制作用。经血管外膜转染εPKC siRNA后,内膜增生被抑制,其中CD68、PCNA阳性细胞均减少。高糖培养24h后,VSMCs增殖和迁移较对照组显著。尼可地尔抑制了高糖诱发的VSMCs细胞增殖和迁移,尼可地尔-5-HD共处理组VSMCs增殖和迁移较尼可地尔组增强。与转染NC siRNA的VSMCs相比,转染εPKC siRNA的VSMCs细胞增殖和迁移也明显下降。雷帕霉素组大鼠再内皮化被抑制,尼可地尔可逆转雷帕霉素造成的再内皮化延迟。球囊拉伤组大鼠动脉ROS上升,雷帕霉素组大鼠动脉ROS进一步上升,尼可地尔-雷帕霉素共处理使血管中ROS下降。NAC抗氧化应激后,大鼠颈动脉再内皮化面积增加。球囊拉伤血管中XO蛋白升高,雷帕霉素使拉伤的颈动脉中XO蛋白进一步升高,雷帕霉素-尼可地尔共处理组大鼠颈动脉中XO蛋白下降。另外,雷帕霉素-尼可地尔共处理组大鼠颈动脉eNOS mRNA表达水平较雷帕霉素组上升。细胞实验发现,雷帕霉素诱导CMECs凋亡和ROS升高,雷帕霉素-尼可地尔共处理组CMECs凋亡率、caspase 3活性及ROS均较之下降。雷帕霉素干预后,转染XO siRNA的CMECs凋亡率、caspase 3舌性及ROS均较转染NC siRNA的CMECs降低。雷帕霉素抑制了CMECs增殖和迁移,而雷帕霉素-尼可地尔共处理使细胞增殖及迁移较之增强。雷帕霉素干预后,转染XO siRNA的CMECs迁移及增殖均较转染NC siRNA的CMECs增强。雷帕霉素抑制CMECs内Akt磷酸化,雷帕霉素-尼可地尔共处理组细胞Akt磷酸化水平升高。CMECs中转染Akt siRNA后eNOS mRNA表达被抑制。结论：1.尼可地尔抑制糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,并抑制细胞增殖和炎性细胞浸润。尼可地尔也抑制了高糖诱发的VSMCs增殖和迁移。2.尼可地尔开放mitoK+ ATP通道来抑制εPKC通路激活,并通过该机制抑制糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生、减少细胞增殖和炎性细胞浸润。3.尼可地尔促进动脉球囊拉伤后再内皮化进程,其与雷帕霉素共作用弥补了雷帕霉素在抑制内膜增生的同时也抑制了再内皮化的不足。4.在球囊损伤血管及CMECs中,雷帕霉素诱导了XO蛋白升高并促进ROS生成。5.尼可地尔抑制了血管及CMECs中XO的升高,减少了XO来源的ROS：尼可地尔同时促进了被雷帕霉素抑制的Akt/eNOS表达：从而减轻雷帕霉素诱导的CMECs凋亡和氧化应激,促进了CMECs的增殖和迁移,并促进了再内皮化。
[Abstract]:Objective: to establish rat carotid artery balloon injury model, the model of diabetic rats, and cultured vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells from animal cell molecular level verification of nicorandil inhibits balloon injury of rat carotid artery intimal hyperplasia and promote endothelialization effect, provide a theoretical basis for new complications of intervention after the reduction of coronary artery. Methods: intraperitoneal injection of STZ to establish the model of diabetic rats carotid artery balloon injury, divided into two groups: sham operation group (8 rats); the balloon injury group (10 rats); the nicorandil group (10 rats); the total effect of nicorandil -5HD (10 rats) group.20 rats by blood vessel the outer membrane was transfected into siRNA:NC (10) siRNA group; siRNA Group E PKC (10).PCNA immunohistochemical analysis of cell proliferation; CD68 immunohistochemical analysis of inflammatory cell infiltration. Intravascular VSMCs were cultured and divided into groups: control group, high glucose; 缁，

本文编号：1492522