调控温度敏感的TRP通道改善线粒体功能障碍防治血管损伤的机制

发布时间：2018-02-19 19:28

  本文关键词： 寒冷 血管紧张素Ⅱ 高血压 线粒体 薄荷醇 辣椒素 TRP通道　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的:高血压和冠状动脉粥样硬化是临床的常见病和多发病,严重危害人类健康。流行病学研究发现高盐、高脂和高糖等不健康饮食以及寒冷气候是导致心血管病发生和加重的危险环境因素。其中寒冷气候是导致高血压的重要环境因素,且不易改变。冬季心脑血管发病率及相关事件显著增加,寒冷应激导致心血管系统的改变以血压升高为主,可导致寒冷性高血压(cold-induced hypertension,CIH)。而高脂饮食会引起血管内皮氧化应激损伤促进动脉粥样硬化的发生。因此,阐明环境因素导致血管损伤的机制对高血压和动脉粥样硬化的防治有重要意义。线粒体功能障碍导致的血管氧化应激损伤是引起高血压和动脉粥样硬化发病的重要病理生理基础。线粒体膜和内质网能协同调节胞浆和线粒体的钙离子(Ca~2+)浓度,胞浆钙离子浓度增加能升高线粒体钙离子浓度。细胞内钙超载伴随ROS的产生增加。血管紧张素Ⅱ和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)干预会损伤线粒体呼吸功能导致ROS生成大量增加。线粒体功能异常是导致细胞氧化应激损伤的主要原因,其中Ca~2+内流增加起关键作用。在血管平滑肌细胞线粒体ROS可激活胞膜上的L-型Ca~2+通道促进细胞外Ca~2+内流,激活RhoA和Rho激酶信号通路,进一步促进血管平滑肌收缩增加血管张力。血管内皮细胞ROS过量生成会导致一氧化氮生物利用度降低,损伤血管功能。使用线粒体特异性的ROS清除剂能有效降低ROS水平并改善上述病理生理改变。瞬时受体电位通道[Transient receptor potential(TRP)channels]是一类非选择性阳离子通道超家族,在哺乳动物不同组织细胞广泛表达。TRP通道有分为TRPCs、TRPVs、TRPPs和TRPMs等多个亚型。其中Trpm8和Trpv1对温度敏感,又被称为温度敏感性TRP通道(Thermo-TRPs)。Trpm8能被10℃~23℃的寒冷温度及薄荷醇激活介导冷感觉,故Trpm8又称为冷通道。Trpv1可被高于43℃的温度及食物中的辛辣刺激成分激活辣椒素激活,故Trpv1又称为辣椒素受体。近年研究发现激活Trpm8/v1在调控细胞Ca~2+信号中起重要作用。我们前期研究发现棕色脂肪有大量Trpm8表达,激活血管组织Trpm8能抑制血管收缩反应,长期薄荷醇胶囊干预能显著降低高血压前期受试者的血压及改善血管舒张功能,且心率也有降低。激活Trpv1可激活Ca~2+敏感的PKA调节eNOS活性,促进NO生成改善血管功能。我们及他人既往研究提示激活Trpm8或Trpv1可调控血管平滑肌细胞和内皮细胞的线粒体功能,改善高盐、高糖等环境代谢因素导致的心血管损伤中起着重要的作用。因此,我们推测激活Trpm8可通过改善血管平滑肌细胞线粒体功能拮抗寒冷导致的血管功能障碍和高血压;激活Trpv1可缓解ox-LDL导致的内皮细胞线粒体功能障碍。本研究分两部分进行。第一部分为激活Trpm8调控线粒体功能拮抗寒冷性高血压的机制研究。第二部为激活Trpv1改善ox-LDL诱导的内皮线粒体功能障碍的研究。探讨了膳食因子激活TRP通道在拮抗环境因素导致的心血管损伤中的作用。材料方法:本研究由离体和在体两部分实验组成。离体实验以原代小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞、胸主动脉、肠系膜动脉和人脐静脉内皮细胞为研究对象。在体实验采用寒冷(4℃冷刺激24周,每天干预4小时)和血管紧张素Ⅱ诱导(0.7 mg/kg per day,14天)的C57BL/6J背景的野生型(wild type,WT)和Trpm8基因敲除(Trpm8-/-)小鼠建立高血压小鼠模型,给予普通饲料(普食组)或0.5%的薄荷醇饲料(薄荷醇组)喂养。1.原代培养小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测Trpm8在血管平滑肌细胞的定位,以及Trpv1在脐静脉内皮细胞的定位。结合超速离心和测钙鉴定血管平滑肌细胞Trpm8在肌浆网的表达及功能。2.建立寒冷性高血压小鼠模型和血管紧张素Ⅱ诱导的高血压小鼠模型,给予普通饲料或薄荷醇饲料喂养。采用鼠尾血压测量方法监测小鼠鼠尾血压变化。干预结束后应用无线遥测信号检测小鼠24小时动态血压。3.采用小动物超声检测小鼠心脏结构和功能。进行跑台耐力测试(15°斜坡)检测小鼠心脏功能。干预结束后处死取胸主动脉检测ROS生成情况;分离肠系膜动脉检测血管功能的变化。4.应用钙指示剂检测薄荷醇和血管紧张素Ⅱ干预对血管平滑肌细胞胞浆钙和线粒体钙的影响。5.应用ROS荧光指示剂检测薄荷醇和血管紧张素Ⅱ干预对血管平滑肌细胞ROS生成的影响;以及辣椒素和ox-LDL处理对血管内皮细胞ROS水平的影响6.采用高分辨率呼吸测定仪检测薄荷醇和血管紧张素Ⅱ干预对血管平滑肌细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化功能和ROS生成的影响。7.采用高分辨率呼吸测定仪检测辣椒素和ox-LDL对血管内皮细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化功能的影响。采用JC-1法检测线粒体膜电位。8.蛋白免疫印迹法检测薄荷醇和血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞Rho A/Rho激酶信号通路相关蛋白(RhoA、Rho A-GTP、MYPT-1、p-MYPT-1、MLC、p-MLC)表达的影响。9.蛋白免疫印迹法检测辣椒素和ox-LDL对血管内皮细胞PKA/UCP2信号号通路相关蛋白及线粒体蛋白(PKA、p-PKA、UCP2和NDUFA9)表达的影响。结果:1.Trpm8在血管平滑肌细胞胞膜和肌浆网有表达,激活Trpm8可介导肌浆网钙释放增加线粒体钙摄取。2.血管紧张素Ⅱ可导致血管平滑肌细胞线粒体呼吸功能障碍及ROS大量生成,激活L-型Ca~2+通道介导细胞外Ca~2+内流增加,促进线粒体Ca~2+摄取增加。3.薄荷醇激活血管平滑肌细胞Trpm8可减少ROS生成,抑制L-型Ca~2+通道介导的细胞外Ca~2+内流和线粒体Ca~2+摄取,改善血管紧张素Ⅱ导致的线粒体功能受损,而对Trpm8-/-血管平滑肌细胞无效。4.薄荷醇激活血管平滑肌细胞Trpm8可抑制血管紧张素Ⅱ上调Rho A-GTP/RhoA、p-MYPT-1/MYPT-1和p-MLC/MLC比值的作用,而对Trpm8-/-血管平滑肌细胞无效。5.长期薄荷醇膳食干预能减少血管组织ROS的生成及RhoA-GTP/Rho A、p-MYPT-1/MYPT-1和p-MLC/MLC比值的升高,而对Trpm8-/-小鼠无效。6.辣椒素激活血管内皮细胞Trpv1能抑制ox-LDL诱导的内皮细胞线粒体呼吸功能降低和ROS生成增加,使用Trpv1的抑制剂iRTX,PKA抑制剂KT5720或UCP2抑制剂Genipin抑制可阻断辣椒素的作用。7.辣椒素可上调血管内皮细胞p-PKA/PKA、UCP2和NDUFA9的表达,使用Trpv1抑制剂i RTX,PKA抑制剂KT5720或UCP2抑制剂Genipin抑制可阻断辣椒素的作用。结论:1.温度敏感的Trpm8在血管平滑肌细胞胞膜和肌浆网均有表达,激活Trpm8可改善血管线粒体功能。2.激活温度敏感的Trpm8可改善冷应激或血管紧张素Ⅱ导致的血管功能受损,降低血压。3.激活温度敏感的Trpv1可拮抗ox-LDL导致的血管内皮细胞线粒体功能障碍,改善血管内皮功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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本文编号：1517923