靶向纳米载药系统DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf治疗恶性血液病的体内、体外研究

发布时间：2018-02-25 08:07

  本文关键词： 纳米粒 转铁蛋白 柔红霉素 凋亡 靶向给药系统　出处：《东南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的目前为止化疗仍然是肿瘤系统化治疗的主要手段,但是化疗的毒副作用限制了其临床运用。为了增加肿瘤药物的化疗效果,减少药物对正常组织器官的损伤,我们研制一种新型的化疗药物纳米运载系统DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf靶向治疗恶性血液病,并探讨其抗肿瘤的机制。方法采用高分辩透射电镜、扫描电子显微镜、激光粒度分析仪、紫外分光光度计对载药纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf进行物理表征。用倒置荧光显微镜及流式细胞技术(FCM)检测人白血病细胞株K562细胞内柔红霉素(DNR)的累积。构建K562细胞株荷瘤鼠模型,观察纳米药物的抑瘤率及药物的安全性,TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡,免疫组化方法检测凋亡蛋白的表达,Western blotting分析凋亡相关蛋白的表达。FCM检测急性白血病原代细胞的凋亡及细胞内DNR的累积量。结果1、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf纳米粒用去离子水分散超声后通过扫描电子显微镜(SEM)和高分辩透射电镜(HRTEM)观察到的纳米粒形态大多数为球型或近似球型。激光粒度分析仪测得纳米载药粒平均粒径为176.4±11.0 nm,Zeta电位为-19.24±0.12 mV。DNR的包封率和载药量分别为75.12%±1.68%和5.32%±0.15%。结果表明DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf纳米载药粒大小、形状相似、载药量高、稳定,易于保存。2、对于人白血病细胞株K562细胞,无论单药DNR或是载药纳米粒DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf作用于细胞后,倒置荧光显微镜下DNR组和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf-NPs组细胞内均可见DNR分布,后者细胞内DNR浓度高于前者。FCM测得单药DNR和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf处理K562细胞后,相对荧光强度(RFI)分别为8.14±0.29和14.26±0.39,二组之间具有统计学差异(P005)。3、人白血病细胞株K562细胞接种裸鼠成瘤率100%。体内实验发现空白对照组和空白载体纳米组的肿瘤体积分别增长至1,099±238 mm3和1,034±178 mm,两组肿瘤生长速率无明显差别,且肿瘤体积无统计学差异(P0.05)。单药DNR组和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组肿瘤体积分别536±137 mm3和237±85 mm3。用药组肿瘤体积明显小于空白对照组,有显著差异(P0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组肿瘤体积明显比单药DNR组小,具有统计学差异(P0.05),纳米药物抑瘤率比单药DNR明显。而且DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组瘤重量明显低于单药DNR组,两者具有统计学差异(P0.05)。实验结果表明载药纳米柔红霉素抗肿瘤效果优于单药DNR。空白对照组和空白载体纳米组的肿瘤组织细胞凋亡率分别为4.9±0.45%和5.18±0.47%,两组肿瘤细胞凋亡率无统计学差异(P0.05)。单药DNR组和DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组细胞凋亡率分别为22.82±1.38%和31.09±2.63%。用药组肿瘤细胞凋亡率明显高于空白对照组,有显著差异(P0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组肿瘤细胞凋亡率比单药DNR组高,两组之间肿瘤细胞凋亡率,具有统计学差异(P0.05)。表明纳米载药系统可以增强化疗药物促肿瘤细胞凋亡的作用。凋亡蛋白(Caspase 9、Caspase 3及c-PARP)在空白对照组和空白载体纳米组两组表达量无统计学差异(P0.05),在用药组表达量明显高于空白对照组,且DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组表达量高于单药DNR组,两组之间具有统计学差异(P0.05)。空白对照组和空白载体纳米组凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax表达量无统计学差异(P0.05)。用药组Bcl-2表达量及Bcl-2/Bax比值明显低于空白对照组,统计学有显著差异(P0.05)。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf组Bcl-2表达量及Bcl-2/Bax比值低于单药DNR组,两组之间具有统计学差异(P0.05)。体内实验结果显示纳米药物通过内源性凋亡途径促进肿瘤组织细胞凋亡。体内实验过程中裸鼠治疗前后体重无明显变化,饮食、睡眠、精神等无明显异常。荷瘤裸鼠重要脏器无明显损伤,表明纳米药物体内安全性良好。4、急性白血病原代细胞的实验研究发现,DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf诱导细胞凋亡的能力略高于单药DNR,两者无统计学差异(P0.05)；但前者能增加白血病原代细胞内药物浓度,两者有统计学差异(P0.05)。结论1、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf载药纳米粒形状均匀,载药量较高,其结构中的PEG成分及颗粒表面连接的Tf使纳米载药颗粒具备了靶向给药的能力。2、在体外DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf对白血病细胞株K562细胞及急性白血病原代细胞,可以增加细胞内化疗药物的累积。DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf在体内对K562细胞株荷瘤鼠的肿瘤生长有明显抑制作用,且安全性良好。我们推测纳米粒与肿瘤细胞特异性结合,通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞内,随着纳米材料骨架的降解缓慢释放化疗药物,同时纳米载药系统可以延长化疗药物在体内的半衰期,增加药物在体内的蓄积时间,发挥抗肿瘤作用。3、DNR-PLGA-PLL-PEG-Tf通过下调凋亡调节蛋白Bcl-2/Bax比值及上调凋亡蛋白Caspase 9、Caspase 3及c-PARP的表达,通过内源性的凋亡途径增加化疗药物诱导肿瘤组织细胞凋亡的能力。4、新型的纳米载药系统PLGA-PLL-PEG-Tf有可能成为化疗药物的载体,将化疗药物靶向作用于肿瘤,提高化疗药物的疗效,减少药物的副反应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733

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本文编号：1533622