Calpains介导心肌细胞闰盘重塑

发布时间：2018-02-26 13:07

本文关键词： 钙蛋白酶系统心肌肥厚模拟失重缺血再灌注损伤闰盘心肌重塑　出处：《第四军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【研究背景】心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是威胁人类健康的头号杀手。心肌重塑在心脏从代偿阶段向失代偿阶段即心力衰竭(heart failure,HF)转化中扮演重要角色,所以对于心肌重塑的干预一直是临床治疗心肌疾病和基础研究心衰发生机制的重点。闰盘是心肌细胞间的重要连接结构和代谢活跃区域,也是新生肌节加入的地方。闰盘重塑在心肌重塑过程中起重要作用,然而,参与闰盘重塑的蛋白及其调节因素还不清楚。由于在多种心肌疾病中,心肌细胞内都会出现钙超载现象。钙蛋白酶calpains是钙依赖性蛋白水解酶,calpastatin是其内源性抑制剂,参与Ca2+介导的细胞内生理或病理生理过程。本实验室前期的研究发现calpain-2和calpastatin在心肌闰盘处大量分布,尚无calpain-2和calpastatin在闰盘处作用的相关研究。因此,本实验利用尾部悬吊4周模拟失重大鼠模型(4-week of tail-suspended rats,SUS)、离体心肌局部缺血再灌注损伤模型(ischemia-reperfusion injury,I-R)、腹主动脉缩窄(transverse abdominal aortic constriction,TAC)高血压心肌肥厚模型等不同心脏重塑模型,比较calpain-2和calpastatin在不同闰盘重塑过程中的异同点,认为calpains可能通过调节钙黏蛋白N-cadherin参与维持闰盘正常结构和新生肌节的加入,在闰盘重塑中起重要的降解老蛋白质和维持新蛋白质合成环境的作用。【研究目的】(1)观察calpain-2和calpastatin在心肌闰盘上的定位(2)比较对照组(con)、sus组、i-r组和tac组闰盘处calpain-2和calpastatin的分布(3)观察闰盘在con组、sus组、i-r组和tac组中心脏重塑过程中的变化(4)探索calpains在闰盘重塑中的作用及其底物【研究方法】本实验采用免疫组织化学、免疫荧光、包埋前免疫电镜和包埋后免疫电镜等多种方法,验证calpain-2和calpastatin在心肌细胞内的表达及定位;心肌组织冰冻切片和胶原酶消化的单个心肌细胞分别进行免疫标记,采用激光扫描共聚焦显微成像技术,观察calpain-2和calpastatin在心肌组织和单个心肌细胞中的表达和定位;采用尾部悬吊4周模拟失重大鼠模型、大鼠离体局部心肌缺血再灌注损伤模型和腹主动脉缩窄高血压大鼠心肌肥厚模型构建不同的病理情况下心肌重塑模型;用透射电子显微镜技术,观察心肌重塑过程中心肌肌原纤维和闰盘的超微结构变化;利用体外培养新生大鼠心肌细胞的方法,通过ca2+载体a23187提高细胞内游离ca2+浓度来激活calpain,或使用calpain特异性抑制剂pd150606来抑制calpain的活性;使用calpainglotmproteaseassay检测试剂盒荧光素酶生物发光法检测细胞内calpain活性的变化,以证实培养的心肌细胞内calpain的活性受到a23187或pd150606的调节;最后用细胞免疫荧光和激光共聚焦显微成像技术,观察n-cadherin和cx-43的表达分布情况。【研究结果】(1)心肌细胞的闰盘有calpain-2和calpastatin等多种蛋白质的分布。免疫组织化学和细胞免疫荧光结果显示calpain-2在心肌细胞中呈横纹状分布,且在闰盘处有中等量的聚集。用闰盘结构蛋白n-cadherin、cx-43标记闰盘位置,与calpastatin进行免疫双重标记结果显示calpastatin在心肌细胞中散在分布,在闰盘处大量聚集。包埋前免疫电镜和包埋后免疫电镜进一步确定了calpain-2和calpasatatin在心肌超微结构中的定位,calpain-2主要集中在z盘和闰盘分布,故在免疫组化和免疫荧光图像中呈横纹状;calpastatin在整个心肌细胞内都有分布,闰盘大量分布,在超微结构上的分布无明显特征,与免疫荧光结果一致。(2)calpastatin在sus大鼠重塑心脏中未发生明显变化,calpain-2在sus大鼠心脏中明显向心肌细胞核转位。尾部悬吊4周模拟失重大鼠诱导心脏重塑,sus组与con组相比,比目鱼肌萎缩明显,但心脏体重比未见明显变化。westernblot检测calpain-2与calpastatin的表达量,sus组与con组之间未见明显差异;免疫荧光显示calpain-2和calpastatin在闰盘处的分布亦未见明显差异,calpain-2在sus组有明显向细胞核转位的现象,可能与sus组心肌细胞凋亡易感性增加有关。(3)calpastatin和n-cadherin在离体局部缺血再灌注损伤心脏梗死区表达明显降低。大鼠离体局部心肌缺血再灌注损伤心脏中,利用cx-43和p-cx-43在梗死区表达降低,在正常区域内表达正常的特点来定位心肌缺血再灌注损伤边缘区域。在损伤边缘区,靠近梗死区域的一侧calpastatin表达明显降低,尤其是闰盘处的分布特征完全消失,在靠近正常区域的一侧,calpastatin的表达和分布与正常对照组相似,无明显变化。在梗死区域内,n-cadherin的表达明显降低。透射电子显微镜观察损伤边缘区域闰盘的变化,发现正常心肌细胞中,末端肌节的肌丝与闰盘紧密相连,死亡的心肌细胞末端肌节与闰盘边缘的距离明显增加,肌丝与闰盘之间的连接断裂导致肌节挛缩和细胞死亡。(4)tac大鼠心脏闰盘重塑明显,calpain-2在闰盘处的分布明显增加。腹主动脉缩窄高血压诱导心肌肥厚模型中,透射电镜显示tac心肌闰盘重塑明显,4h后即可见到大量增宽的闰盘,和新生肌节的加入;在12周之后,闰盘重塑持续存在。免疫组织化学染色显示calpain-2在tac心肌闰盘上的分布明显多于con组,calpastatin在心肌闰盘处的分布未见明显变化。(5)calpains被激活后,培养新生大鼠心肌细胞中n-cadherin表达明显降低。在体外培养的新生大鼠心肌细胞中,利用ca2+载体a23187提高细胞内游离ca2+浓度后,检测发现细胞内calpain的活性明显增加,calpain抑制剂pd150606可明显降低a23187的这一效应。calpain被激活后,可见培养心肌细胞内新生肌原纤维装配量明显降低,n-cadherin的表达量明显减少,但是cx-43的表达及分布未见明显变化。pd150606可明显抑制n-cadherin的降解。【研究结论】本研究采用免疫组织化学、免疫荧光、免疫电子显微镜技术从多个层面验证了calpain-2和calpastatin在心肌细胞内的分布,证实了calpain-2和calpastatin在闰盘处的定位;通过建立尾部悬吊模拟失重大鼠、离体心脏局部缺血再灌注损伤和腹主动脉缩窄高血压心肌肥厚等模型,观察不同心肌重塑过程中闰盘的重塑特点,发现在肥大心肌细胞生长过程中,闰盘是新生肌节加入的地方,并且calpain和calpastatin在闰盘重塑过程中起重要作用。当心肌细胞内游离Ca2+浓度升高时,calpain被激活,降解N-cadherin,破坏闰盘黏着连接的结构,影响肌原纤维在闰盘处的附着点,进而影响肌原纤维的装配,导致肌节挛缩,细胞死亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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