土槿乙酸改善ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究：循环及斑块内单核吞噬细胞的变化及其潜在机制

发布时间：2018-03-02 14:56

本文选题：单核细胞　切入点：动脉粥样硬化　出处：《甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院)》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的和意义:动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是心脑血管疾病的基础病变,由粥样斑块导致血管重塑所引起相应部位的缺血和出血事件,是全世界致残、致死的重要病因。慢性炎症和脂质浸润学说是广大学者公认的AS的发病机制,单核/巨噬细胞系作为机体固有免疫系统的重要防线,参与了机体慢性炎症和斑块内脂质代谢的过程,其动态变化在AS发生发展过程中起至关重要的作用。土槿乙酸(pseudolaric acid-B,PB)是一种药理作用很丰富的中药提取物,目前已发现有抗肿瘤、抗生育、抗血管生成和抗真菌的作用。本人所在研究团队的前期工作显示PB可以激活单核细胞表面过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR),且有研究表明PPAR能够参与炎症反应和脂质代谢的过程。因此,我们提出以下假说,PB通过调节单核/巨噬细胞系的变化参与慢性炎症和斑块内脂质代谢,调节AS的发生发展过程。研究方法,第一部分:以8周龄雄性Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠作为研究对象,高脂饮食喂养8周形成AS后,随机分为基线组(n=7)、高脂饮食组(n=7)、PB+高脂饮食组(n=7)、正常饮食组(n=7)和PB+正常饮食组(n=7)。基线组直接取材,其它各组干预4周后取材。进行如下检测:(1)流式细胞术检测各组外周血单核细胞亚群(Ly6Chi:Ly6G-CD11b+Ly6Chi,Ly6Clo:Ly6G-CD11b+Ly6Clo)比例的变化;(2)免疫荧光染色检测主动脉根部增殖巨噬细胞;(3)油红O染色检测主动脉、颈总动脉和主动脉根部AS斑块负荷的面积;(4)酶联免疫分析(Enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)法检测血浆中甘油三酯和总胆固醇的水平。第二部分:以RAW264.7(小鼠巨噬细胞系)为研究对象,含有荧光素标记的氧化型低密度脂蛋白(fluorescence Dil-labeled oxidized low density lipoprotein,Dil-ox-LDL)的培养基培养RAW264.7细胞,分为模型组、PB组和PB+GW966.2(PPARγ阻断剂)组,每组3个样本,流式细胞术检测细胞内Dil-ox-LDL的荧光强度。含有氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)培养基培养RAW264.7细胞24小时后形成泡沫细胞,分为模型组、PB组和PB+GW966.2(PPARγ阻断剂)组,每组3个样本,进行如下检测:(1)油红O染色检测泡沫细胞形成;(2)Real-time PCR检测PB对PPARγ、肝X受体(liver X receptors,LXR)、ATP-结合盒(ATP-binding cassette transporter 1,ABC1)和CD36基因表达量的影响。研究成果:动物研究发现(1)PB+高脂饮食组有降低Ly6Chi单核细胞亚群的趋势,正常饮食组和PB+正常饮食组降低Ly6Chi单核细胞亚群的比例;(2)PB+高脂饮食组有降低斑块内增殖巨噬细胞的密度的趋势,正常饮食组和PB+正常饮食组降低斑块内增殖巨噬细胞的密度;(3)PB+高脂饮食组有降低血浆总胆固醇和甘油三酯水平的趋势,正常饮食组和PB+正常饮食组降低血浆总胆固醇、甘油三酯的水平;(4)PB+高脂饮食组和正常饮食组均有降低主动脉根部、颈总动脉和主动脉的斑块负荷的趋势,PB+正常饮食组降低主动脉根部、颈总动脉和主动脉的斑块负荷。细胞研究发现(1)PB降低巨噬细胞内Dil-ox-LDL的荧光强度;(2)PB能降低泡沫细胞内PPARγ、LXRα和ABC1的表达量。结论及意义:1.高脂饮食可以升高Apo E-/-小鼠体内甘油三酯和总胆固醇水平,使Ly6Chi单核细胞亚型的比例、斑块内增殖巨噬细胞的密度升高,促进AS的形成。PB+高脂饮食组有降低脂质、Ly6Chi比例、增殖巨噬细胞密度和斑块负荷的趋势。正常饮食组降低脂质、Ly6Chi比例和增殖巨噬细胞密度,有降低斑块负荷的趋势。PB+正常饮食组不但能延缓AS病变的恶化,而且能逆转动脉粥样斑块的进程,减低斑块负荷量。2.PB增强PPARγ的表达量,通过PPARγ-LXRα-ABC1通路调节脂质吞噬和排出的平衡,降低巨噬细胞内脂质聚集的量,抑制泡沫细胞形成,在早期干预AS发生发展过程。3.本研究首次证实了PB联合饮食干预有防治动脉粥样硬化的作用,进一步发掘了传统中药土槿皮的药用价值。
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【学位授予单位】：甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5

【参考文献】