骨髓增生异常综合征患者成骨细胞的异常改变及其在骨髓微环境中的作用

发布时间：2018-03-04 08:15

  本文选题：骨髓增生异常综合征　切入点：成骨细胞　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:本研究采用细胞培养、流式细胞术(FCM)、实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCT)、Westen Blot蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附实验(ELISA)等多种实验技术和方法检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者成骨细胞的数量、功能及相关信号通路,初步揭示成骨细胞在MDS中的异常变化,并进一步探索成骨细胞在MDS造血功能异常机制中可能的作用。在体外实验中显示,MDS患者成骨细胞数量减少,功能下降,信号通路异常,对正常干细胞的数量、质量产生不良影响,可能在MDS发生、发展,及其转化为急性髓系白血病中起重要作用。背景:MDS是以老年人为主要发病人群的造血干细胞恶性克隆性疾病,其特点是造血功能低下,转化为急性髓系白血病的风险增加。近年来的研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSC),如造血干细胞(HSC)与恶性克隆异常相互作用,造血细胞生长因子和细胞因子异常分泌等的改变,有助于MDS的发病机制。研究发现,间充质细胞在骨髓微环境,包括成骨细胞和骨细胞、网状细胞和脂肪细胞,在造血调控中发挥重要作用。成骨细胞是干细胞早期分化的关键。作为骨髓微环境的重要组成部分,成骨细胞在MDS的疾病发生、发展中起重要的作用。材料与方法:本实验选取2015年9月至2017年2月天津医科大学总医院血液科初治MDS患者38例。所有患者均按照2008版WHO关于MDS的诊断标准,并依据WPSS评分(表6)将病例组分为Group1(WPSS:0~2分,中低危组)18例和Group2(WPSS:3~6分,高危组)20例。正常对照组25名。应用骨髓培养法,体外培养MDS患者成骨细胞,并检测其数量功能。将正常骨髓单个核细胞分别与MDS患者及正常对照组成骨细胞混合培养后,检测HES1、Cyclin D1等信号通路靶基因的变化,并于体外培养干祖细胞集落,检测集落形成数目。磁珠分选正常对照组CD34~+细胞,分别加入MDS患者及正常对照组成骨细胞进行混合培养,应用FCM检测白血病干细胞(LSC)细胞比例、细胞凋亡比例。应用FCM、RT-PCT检测Jagged1、HES1、Cyclin D1等信号通路中关键基因,ELISA法检测MDS患者骨髓上清液及成骨细胞培养液中TGF-β的表达水平,Western blot免疫印迹法检测成骨细胞β-catenin/磷酸化β-catenin蛋白水平。探索并初步阐明MDS患者成骨细胞的异常变化及成骨细胞在MDS骨髓微环境中的作用。结果:第一部分、采用骨髓培养法,条件培养基,在MDS患者骨髓中,可体外培养并纯化出成骨细胞。MDS患者(6.29±6.57%vs13.01±6.29%,p0.05)尤其是高危MDS(5.39±5.96%vs 13.01±6.29%,p0.01),骨髓中成骨祖细胞数量较正常对照组减少。高危组MDS患者成骨细胞数量(4.62±0.62 vs 6.79±0.79,p0.05)减少。MDS患者(3.61±0.47%vs 6.55±1.46%,p0.05)尤其高危组(2.83±0.44%vs 6.55±1.46%,p0.05)MDS患者成骨细胞中OCN~+CD34~-LIN~-比例明显低于正常组,其表达的骨形成蛋白2(BMP2)较正常对照组(2.51±0.51 vs 4.37±1.14,p0.05)明显减低。MDS患者正常功能成骨细胞比例,于其骨髓中原始细胞呈反比,于其外周血中性粒细胞绝对值及血红蛋白浓度呈正比。第二部分、正常骨髓细胞,分别与MDS患者及正常成骨细胞共培养后,进行干祖细胞培养,MDS组干祖细胞集落形成较正常组减少,其中CFU-GM形成明显少于正常组(6.5±3.57 vs 17.9±7.11,p0.01)。MDS组中骨髓细胞HES1(3.90±1.23 vs 1.72±0.49,p0.05)及CyclinD1(20.24±5.00 vs 6.80±2.85,p0.05)两个肿瘤相关基因表达增高。分选正常人CD34~+细胞,分别与MDS患者及正常成骨细胞共培养后,检测其凋亡MDS组较正常组增高(19.51±5.89%vs5.84±4.15%,p0.001),而LSC比例MDS组明显增加(6.80±0.89%vs 2.50±1.56%,p0.001)。第三部分、MDS患者成骨细胞Jagged1(24.34±13.27%vs 12.54±5.89%,p0.05)、RANKL(3.68±2.60 vs 2.24±2.09,p0.05)及HES1(3.23±0.78 vs 1.71±0.44,p0.05)、CyclinD1(6.17±1.34 vs2.02±0.73,p0.05)表达增高。在培养体系中加入了Notch通路抑制剂DAPT后,其靶基因HES1表达明显下降(3.39±0.85 vs0.38±0.15,p0.01),而Wnt通路的靶基因CyclinD1表达增高(9.15±2.27 vs48.40±6.82,p0.01)。MDS患者骨髓上清(268.98±113.19 vs 366.96±218.64,p0.05)及成骨细胞培养液中(50.49±27.49 vs 80.54±29.11,p0.05)TGF-β含量较正常降低,治疗后,骨髓CR患者的TGF-β含量上升,在骨髓上清中甚至超过了正常对照组的水平(600.21±404.95 vs 366.96±218.64,p0.05)。β-Catenin在MDS患者成骨细胞中的表达增高,磷酸化β-Catenin是其活化形式,表达增高尤其明显。结论1、采用骨髓培养法,应用条件培养基,在MDS患者骨髓中,可体外培养并纯化出成骨细胞。MDS患者骨髓中成骨祖细胞数量较正常对照组减少。MDS患者成骨细胞数量减少,成骨能力较正常对照组明显减低且与临床指标相关。2、MDS患者成骨细胞,增加骨髓细胞中HES1、CyclinD1表达,抑制正常骨髓干祖细胞的分化增殖,并可诱导恶性克隆性细胞的产生。3、MDS患者骨髓及成骨细胞培养液中,TGF-β含量降低,成骨细胞RANKL、Jagged1及HES1、Cyclin D1表达增高,β-Catenin表达增高,相关信号通路被激活。4、MDS患者成骨细胞发生数量、功能、信号通路的异常变化,并可能因此改变了MDS患者骨髓微环境。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R551.3

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