DSG2基因缺陷致ARVC的实验研究

发布时间：2018-03-06 22:35

本文选题：致心律失常性右室心肌病　切入点：桥粒芯糖蛋白2　出处：《南京医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分DSG2基因沉默对小鼠P19向脂肪细胞诱导分化的影响背景:致心律失常性心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)的特征性病理改变是心肌进行性地被纤维或纤维脂肪组织替代。约50%的ARVC患者携带有桥粒基因突变。基因命运图谱和谱系示踪方法证实,ARVC的右室脂肪细胞来源于第二生心区前体细胞。已有研究报道心脏前体细胞过表达PG可使PG核内定位增加,从而引起脂肪相关基因表达增加,并促进胞质内脂滴生成。我们先前的研究发现,DSG2基因沉默心房肿瘤细胞系HL-1细胞后,细胞的纤维相关指标(Col1a1,Col1a2,Col3a1)、脂肪相关指标(Adiponectin,PPAR-γ,C/EBP-α)以及细胞凋亡显著增加,出现类似于人类ARVC的分子改变。然而,ARVC疾病中DSG2与心脏前体细胞脂肪生成的关系尚不明确。目的:以小鼠P19细胞作为实验细胞,探讨应用96孔板悬浮法诱导P19细胞体外向脂肪细胞分化的可行性和有效性,并分析DSG2基因沉默对P19细胞分化的类脂肪细胞脂肪相关基因m RNA表达水平的影响。方法:P19细胞使用96孔板悬浮培养法制备拟胚体(embryonic bodies,EBs),其中第3天至第5天使用诱导剂全反式维甲酸(All trans-retinoic acid,at RA)。第7天挑取EBs用胰岛素和三碘甲状腺原氨酸(3,3’,5-triiodo-L-thyronine,T3)诱导,继续贴壁培养20天后,油红O染色鉴定分化细胞的特征,分别于贴壁期第5、10、15、20天提取总RNA,荧光定量PCR检测诱导分化过程中脂肪相关基因(Adiponectin,PPAR-γ,C/EBP-α)的表达变化。设计并合成针对DSG2基因编码区的干扰序列,构建真核细胞表达质粒并转染P19细胞,遗传霉素(geneticin,G418)筛选获得稳定转染细胞株,荧光定量PCR检测DSG2的沉默效率,并观察沉默效率最佳的稳定转染细胞株分化的类脂肪细胞脂肪相关基因m RNA表达水平的改变。结果:使用96孔板悬浮培养法可以形成大小均一的EBs,诱导结束后EBs生长晕周围部分细胞分化为脂肪细胞。细胞形态趋于类圆或圆形,胞质中出现小脂滴,可被油红O染色清晰显示,同时实时定量PCR结果显示与未分化的P19细胞相比,诱导分化结束时PPARγ、C/EBPα和adiponectin的表达量分别增加了50.57倍(P0.01)、21.65倍(P0.01)和168.89倍(P0.01)。Sh DSG2重组质粒转染P19细胞后,筛选出对DSG2基因m RNA表达抑制效率最显著的Sh DSG2-1373组(68.06%,P0.01),诱导其向脂肪细胞分化后,发现与对照组Sh DSG2-si NC组相比,Sh DSG2-1373组分化的类脂肪细胞脂肪相关基因m RNA的表达明显增加,PPARγ、C/EBPα、adiponectin分别上调了16.24倍(P0.01)、7.67倍(P0.01)和29.05倍(P0.01)。结论:使用96孔板悬浮法获得的P19细胞EBs在体外可诱导分化为脂肪细胞。DSG2基因沉默明显增加P19细胞分化的类脂肪细胞脂肪相关基因m RNA的表达,提示DSG2可能参与ARVC的脂肪生成。第二部分心脏特异表达DSG2-F536C转基因小鼠的表型进展研究背景:我们对一个中国汉族ARVC家系临床随访中发现家系中ARVC患者表现出典型的心电图改变和超声心动图的演变,通过基因筛查筛选出一个高度保守的DSG2-F531C错义突变,可导致第531位的半胱氨酸被丙氨酸替代。随后,我们建立了相应突变的心脏组织特异性表达DSG2-F536C转基因小鼠模型,对其表型分析发现突变型转基因小鼠于出生后6周开始出现射血分数(ejection fraction,EF)和短轴收缩率(fractional shortening,FS)下降,Masson染色示左心室出现局灶性纤维化,出现类似ARVC表型,提示我们DSG2-F531C突变是具有致病性的突变,然而该突变对ARVC疾病进展的影响尚不明确。目的:比较15周龄和30周龄转基因小鼠心脏纤维化及心室电重构相关的Connexin43表达和定位的变化,明确DSG2-F531C对ARVC疾病进展的影响。方法:以心脏特异性表达DSG2转基因小鼠(W39)为对照组,心脏特异性表达DSG2-F536C转基因小鼠(M35)为实验组,Masson染色对比观察15周龄和30周龄转基因小鼠心脏组织学改变;免疫组化评价Connexin43表达和定位的变化。结果:转基因小鼠的纤维沉积局限于左心室游离壁,右心室及室间隔心肌细胞间未见明显蓝色纤维组织。15周龄时,W39组小鼠心肌细胞结构清晰,排列整齐有序,细胞间隙未见明显胶原纤维存在,M35组小鼠心肌细胞结构尚清晰,排列稍紊乱,心肌细胞间隙胶原纤维沉积明显增加;30周龄时,W39组小鼠未见明显胶原沉积,而M35组小鼠正常心肌排列破坏,细胞间质可见大量胶原纤维沉积,将心肌细胞分散包裹形成一个个隔离岛样结构。胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)示W39组小鼠15周龄与30周龄时的CVF无统计学差异(0.44%vs 0.64%,P0.05),15周龄M35组小鼠CVF较同龄对照组明显升高(5.52%vs 0.44%,P0.05),且30周龄M35组小鼠CVF较15周龄同组小鼠明显增多(15.10%vs 5.52%,P0.05)。免疫组化染色示转基因小鼠对照组(W39)和实验组(M35)Connexin43仍定位在闰盘区,心肌细胞侧膜及胞质内均无阳性着色,但闰盘区的Connexin43表达较阳性参照均明显下调,两组间无统计学差异。结论:DSG2-F536C转基因小鼠表现出年龄依赖性的心肌纤维化表型,证实DSG2-F531C致病突变导致的ARVC是进展性心肌病。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2

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