基于纳米材料再造心肌组织生物学评价与心梗治疗研究

发布时间：2018-03-09 23:02

  本文选题：心肌组织工程　切入点：心梗　出处：《哈尔滨工业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：心肌组织工程为缺血性心脏疾病治疗提供了新的治疗策略。研究人员目前在体外已成功构建了具有节律性收缩的再造心肌组织或工程化心肌组织(Engineered cardiac tissues,ECTs),在体内心梗修复方面也取得显著成效。然而,考虑到心肌组织本身的电生理特性,以往用于心肌组织构建的支架材料难以为心肌细胞提供导电微环境,所构建的ECTs仍缺乏天然心肌的收缩-兴奋耦联与电传导特性。近年来,导电纳米材料在电传导特性的组织构建研究中受到研究人员的高度关注,其中石墨烯已被证实在生物医学尤其是组织工程研究中具有良好的应用前景。此外,ECTs的体内示踪对于评价其对心梗治疗效果及细胞行为至关重要。在诸多标记手段中,氧化铁纳米粒(Iron Oxide Nanoparticles,IRONs)因其良好的生物相容性及易检测等优势广泛应用于体内细胞移植及ECTs的示踪中。但针对IRONs对心肌细胞微结构及细胞活性影响,尤其是三维ECTs中闰盘的形成影响尚不明确。为此,本论文重点阐明IRONs对心肌细胞微结构及细胞活性的影响,尤其是三维ECTs中闰盘形成的影响规律,并以氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)-明胶为材料,在明确其对棕色脂肪干细胞(Brown Adipose Derived Stem Cells,BADSCs)作用基础上,研究GO-明胶水凝胶携带IRONs标记的BADSCs在心梗心肌中的分布及分化影响规律,具体研究结果如下:(1)IRONs对心肌细胞微结构及生物活性影响:共沉淀法制备IRONs,表面修饰巯基丁二酸(2,3-Dimercaptosuccinic Acid,DMSA)后制备DMSA-IRONs。通过组织学染色及western blotting等检测,表明DMSA-IRONs对心肌细胞微结构分布影响较小。同时,在心肌细胞活性影响方面,体外3,3-二氨基联苯胺颜色反应证明了DMSA-IRONs能够发挥类似过氧化酶的活性降低活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,DMSA-IRONs在H2O2处理的心肌细胞内同样清除了部分ROS,对心肌细胞起到了保护作用。(2)DMSA-IRONs对ECTs中闰盘结构的影响:在基于胶原/Matrigel构建的三维ECTs中,DMSA-IRONs标记后,透射电镜及普鲁士蓝染色显示细胞对DMSA-IRONs的吸收与其在ECTs中的分布位置有关,ECTs边缘的细胞大量摄取DMSA-IRONs,而ECTs内部细胞摄取较少,且内吞的DMSA-IRONs分布于细胞质及囊泡中。在闰盘结构形成方面,通过免疫荧光及western blotting检测,证实DMSA-IRONs促进ECTs中缝隙结构的形成,降低粘着连接及桥粒的形成。(3)GO-明胶水凝胶对BADSCs向心肌细胞分化影响研究:制备含不同浓度GO的甲基丙烯酸酯明胶(GO-Gel MA)水凝胶,GO对水凝胶多孔状结构无明显影响,但增加了水凝胶的电容性。通过结晶紫染色、MTT检测等筛选出适合BADSCs粘附及细胞活性的GO-Gel MA水凝胶,同时GO的掺入未明显影响BADSCs的增殖,而免疫荧光染色、western blot检测显示,GO-Gel MA水凝胶明显促进了BADSCs向心肌细胞的分化及电传导相关蛋白connexin 43的极化分布及表达,并且诱导了ILK-Akt-Erk1/2细胞信号的表达。(4)GO-Gel MA水凝胶携带掺杂锌的氧化铁磁纳米粒标记的BADSCs进行的心梗治疗研究:利用热分解铁前体物质的方法制备掺杂锌的磁纳米粒,经DMSA表面修饰制备形成具有良好分散能力的磁纳米粒,其大小为4.8±0.6 nm。GO-Gel MA水凝胶携带磁纳米粒标记的BADSCs进行大鼠心梗模型注射,经心脏超声、MRI技术、组织学染色等表明,GO-Gel MA水凝胶促进了BADSCs在心梗区的存活、迁移及分化,并增加了心脏心室壁的厚度,改善了心脏的收缩功能。综上,本研究首先明确DMSA-IRONs对心肌细胞微结构及细胞活性的影响,证实DMSA-IRONs发挥类似过氧化物酶活性降低细胞内ROS,对心肌细胞起到保护作用;利用三维ECTs研究模型,表明DMSA-IRONs的摄取促进缝隙连接的形成,降低心肌机械性能相关的粘着连接、桥粒斑蛋白表达。另外,在基于导电支架对BADSCs向心肌细胞分化规律与体内心梗移植研究中,GO-Gel MA水凝胶增强BADSCs的伸展,促进向心肌细胞分化的同时,诱导电传导相关蛋白connexin 43的表达及ILK-Akt-Erk1/2信号,同时GO-Gel MA水凝胶携带BADSCs显著增强心脏功能。本研究对未来IRONs及GO的ECTs构建、标记及体内移植应用奠定了研究基础。
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【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22;R318.08
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本文编号：1590645