心脏震波治疗促进心肌动脉生成及其信号转导机制的初步研究

发布时间：2018-03-10 05:12

本文选题：体外心脏震波　切入点：动脉生成　出处：《昆明医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[背景]冠心病(CHD)病死、病残率极高,已成为全球公共卫生领域的一大挑战。现有CHD常规疗法各有其局限性,体外心脏震波治疗(Cardiac shock wave therapy,CSWT)是新兴的CHD无创治疗方法。CSWT对心肌组织发放低能量震波,该物理能量可在心肌组织内产生剪切力和空穴效应,进而发挥其生物学效应。课题组前期临床研究已初步验证了 CSWT的有效性和安全性,相关动物研究表明CSWT有促猪缺血心肌动脉生成效应,而体外细胞实验显示CSWT可上调血管内皮细胞促动脉生成相关因子表达水平。但CSWT促动脉生成效应具体分子机制仍不清楚,有待进一步研究。此外,以灯盏花为代表的中药在临床广泛用于心脑血管病,且疗效明确,CSWT联用中药灯盏花治疗冠心病是否具有协同作用值得探讨。第一部分:CSWT对人心脏微血管内皮细胞的影响及其信号转导机制的研究[目的]选取人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMEC)为研究对象,观察CSWT对HCMEC促动脉生成相关因子eNOS、VEGF、MCP-1和ITGB1表达的影响。同时,观察粘附性斑激酶抑制剂PF-573228和钙敏感钾通道阻断剂Iberiotoxin对CSWT效应的影响以揭示CSWT显效相关信号通路。此外,采用中药灯盏花乙素(SCU)和CSWT联合干预HCMEC探讨二者是否具有协同效应。[方法]1.HCMEC细胞的复苏、传代培养以及稳定细胞实验平台的建立。2.药物干预 HCMEC细胞分为Control组、CSWT组、CSWT+FAK阻断剂PF-573228 组、CSWT+KCa阻断剂Iberiotoxin 组、CSWT+SCU50um 组、CSWT+SCU100um组、CSWT+SCU200um组。不同药物刺激HCMEC细胞48h后收集细胞用于后续心脏振波治疗。3.CSWT处理细胞每个实验组加药刺激48h后接受1次低能量体外震波治疗(0.09mJ/mm2,200Times)。4.经CSWT处理的细胞培养24小时后,实时定量PCR检测ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表达,western blot 实验检测 ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1的表达,免疫组化检测检测ITGB1、eNOS、VEGF、MCPI的表达。[结果]1.与对照组相比,CSWT干预组VEGF、eNOS、MCP-1的mRNA表达均上调(4.61±0.05倍,3.99±0.01倍,1.57±0.09倍),ITGB1的mRNA表达下调(0.54±0.14 倍),差异均有统计学意义(P0.05);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相对表达灰度比值均升高(0.43与0.35,0.63与0.50,0.76与0.54,0.68与 0.63)。2.与 CSWT 组相比,CSWT+PF-57328 组 VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA表达均下调(0.62±0.10倍,0.40±0.02倍,0.98±0.03倍)且差异有统计学意义(P0.05),但 MCP-1 的 mRNA 表达却上调(17.1±0.01);VEGF、eNOS、ITGB1蛋白相对表达灰度比值降低(0.29与0.43,0.37与0.63,0.54与0.63),而MCP-1蛋白相对表达灰度比值却升高(1.05与0.76)。3.与 CSWT 组相比,CSWT+Iberiotoxin组VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA 表达均下调(0.53±1.02倍,0.64±0.02倍,0.35±0.01倍)且差异有统计学意义(P0.05),MCP-1的mRNA表达也下调(0.82±0.02)但差异无统计学意义(P0.05);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相对表达灰度比值均降低(0.30 与 0.43,0.30 与 0.63,0.48 与 0.76,0.54 与 0.63)。4.与CSWT组相比,CSWT+SCU50um组VEGF的mRNA表达上调(5.98±0.05 倍),差异有统计学意义(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表达降低(0.29±0.02 倍,1.39±0.03 倍 0.39±0.01 倍);VEGF、eNOS蛋白相对表达灰度比值均升高(0.87与0.43,0.65与0.63,0.33与0.76),MCP-1、ITGB1蛋白相对表达灰度比值则降低(0.33与0.54,0.51与0.63)。5.与CSWT组相比,CSWT+SCU100um组VEGF的mRNA表达上调(5.29±0.31 倍),差异有统计学意义(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表达降低(0.27±0.04 倍,0.42±0.03 倍,0.,31 ±0.04 倍);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相对表达灰度比值均降低(0.03与0.35,0.13与0.50,0.31与 0.54,0.18与 0.63)。6.与CSWT组相比,CSWT+SCU200um组VEGF的mRNA表达上调(5.19±0.66 倍),差异有统计学意义(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表达降低(0.43±0.02 倍,0.86 ± 0.04,倍 0.,41±0.01 倍);VEGF、MCP-1、ITGB1蛋白相对表达灰度比值均降低(0.22与0.35,0.38与0.54,0.42与0.63),而eNOS蛋白相对表达灰度比值升高(0.87与0.50)。7.免疫组化检测各组间eNOS、VEGF、MCP1表达量无显著差异。[结论]1.CSWT可活化HCMEC上调eNOS,VEGF和MCP-1的表达水平,从而产生促动脉生成效应;2.KCa和整合素-FAK信号轴可能参与了 CSWT诱导HCMEC表达eNOS和VEGF的机械信号转导过程;KCa可能作为机械感受器参与了 CSWT诱导HCMEC表达MCP-1的信号转导过程,但整合素-FAK信号轴可能不是该信号转导通路的一部分。3.CSWT联合SCU干预HCMEC具有上调eNOS和VEGF表达水平的协同作用,该协同作用在SCU中低剂量组更为明显。第二部分:CSWT对心肌梗死SD大鼠促动脉生成效应及其信号转导机制的研究[目的]选取人SD大鼠为研究对象,探讨CSWT对SD大鼠促动脉生成相关的eNOS、VEGF、MCP-1和ITGB1表达的影响。同时,观察粘附性斑激酶抑制剂PF-573228和钙敏感钾通道阻断剂Iberiotoxin对CSWT效应的影响以揭示CSWT显效相关信号通路。此外,采用中药灯盏花乙素(SCU)和CSWT联合干预SD大鼠探讨二者是否具有协同效应。[方法]1.采用开胸结扎前降支法建立SD大鼠急性心肌梗死模型2.实验大鼠分为Control组、CSWT组、CSWT+FAK 阻断剂PF-573228 组、CSWT+KCa阻断剂 Iberiotoxin 组、CSWT+SCU10mg/kg 组、CSWT+SCU30mg/kg 组、CSWT+SCU90mg/kg组。所有大鼠均以0.09mJ/mm2能量,按每周三次的频率处理4周。3.完成CSWT刺激方案饲养1周后动物处死,取心肌组织标本进行实时定量 PCR 检测 ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表达,western blot 实验检测 ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表达,免疫组化检测检测ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1的表达。[结果]1.与对照组相比,CSWT治疗组VEGF、MCP-1的mRNA表达均上调(1.62±0.26倍,1.18±0.06倍),但差异无统计学显著性差异(P0.05),ITGB1的mRNA表达上调(2.58±0.05倍),差异有统计学意义(P0.001);而eNOS的mRNA表达则降低(0.96±0.03倍);VEGF、eNOS、ITGB1蛋白相对表达灰度比值降低(1.66与1.86,0.09与0.37,0.50与1.11),而MCP-1蛋白相对表达灰度比值升高(1.24与0.30)。2.与 CSWT 组相比,CSWT+PF-57328 组 VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA表达均上调(2.09 ±0.06倍,2.50 士 0.07倍,2.28±0.02倍)但差异无统计学意义(P0.05),但 MCP-1 的 mRNA 表达却下调 0.71±0.04);eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相对表达灰度比值升高(0.70与0.09,1.73与1.24,0.76与0.63),而VEGF蛋白相对表达灰度比值则降低(0.11与1.66,1.00与1.11)3.与 CSWT 组相比,CSWT+Iberiotoxin组VEGF、MCP-1 的 mRNA 表达均下降(1.58±0.11倍,0.449±0.02倍)但差异无统计学意义(P0.05),eNOS、ITGB1的mRNA表达则升高(1.17 土0.02,2.16土0.01)但差异无统计学意义(P0.05);VEGF、ITGB1蛋白相对表达灰度比值降低(0.77与1.66,0.84与1.11),而eNOS、MCP-1蛋白相对表达灰度比值升高(0.27与0.09,1.59与0.24)。4.与 CSWT 组相比,CSWT+SCU1Omg/kg 组VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1的 mRNA 表达均升高(2.66±0.07 倍,2.29±0.03 倍,2.10±0.03 倍,2.79土0.02)但差异无统计学意义(P0.05);VEGF、eNOS蛋白相对表达灰度比值均升高(1.86与1.66,0.37与0.09),MCP-1蛋白相对表达量则降低(0.30与1.24),ITGB1蛋白相对表达量无变化(1.11与1.11)。5.与CSWT组相比,CSWT+SCU30mg/kg组VEGF的mRNA表达升高(3.03±0.13倍)差异无统计学意义(P0.05),ITGB1的mRNA表达上调(5.08±0.13),差异有统计学意义(P0.001),而eNOS、MCP-1的mRNA表达降低(0.88±0.02 倍,1.01±0.05 倍);VEGF、eNOS、MCP-1 蛋白相对表达灰度比值均升高(1.97与1.66,0.87与0.37,1.45与1.24),ITGB1蛋白相对表达量稍降低(1.01与1.11)。6.与 CSWT 组相比,CSWT+SCU90mg/kg 组VEGF、ITGB1 的 mRNA 表达上调(5.19±0.66倍,3.17±0.04倍),差异有统计学意义(P0.05),而eNOS、MCP-1 的 mRNA 表达降低(0.43±0.02 倍,0.86±0.04 倍);VEGF、eNOS、MCP-1蛋白相对表达灰度比值均升高(2.02与1.66,0.92与0.09,1.70与1.24),ITGB1蛋白相对表达量稍降低(1.05与1.11)。[结论]1.CSWT干预心肌梗死后SD大鼠可上调MCP-1表达水平,但对eNOS和VEGF表达水平影响不显著。2.尚无足够的证据支持KCa和整合素-FAK信号轴是CSWT上调SD大鼠促动脉生成相关因子机械信号转导通路的一部分。3.中药SCU与CSWT联合治疗有促进急性心肌梗死SD大鼠动脉生成协同效应。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4

【参考文献】