一、人CD59分子联合ILY在小鼠体内特异性清除靶细胞方法的建立及其应用 二、3-甲基腺嘌呤对小鼠动脉粥样硬化斑块的抑制

发布时间：2018-03-14 16:52

  本文选题：条件性靶细胞清除　切入点：hCD59　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的近三十年,生物学研究在不断更新的科学技术带动下得到了快速发展。在基因水平的研究中,无论是在体内还是体外,靶基因敲除和过表达技术已经成为研究特定基因功能的强有力的手段。在细胞水平的研究中,针对靶细胞群体的体内清除对研究特定细胞群体的功能和疾病的关系有重要价值。更重要的是,特异性细胞清除还适用于研究细胞的再生、细胞和组织分化,这对再生医学的发展有着深远的意义。然而,目前体内清除细胞技术与基因敲除技术相比相对落后和有限。早期的体内细胞清除研究主要使用诸如外科手术的方法在小鼠体内清除靶细胞群,例如,通过显微解剖、激光清除和抗体介导的细胞清除。但是由于这些方法往往存在技术难度、重复率低、造价高、效果差和对非靶细胞有毒性等弊端,其使用受到限制。近年来,基因工程学方法开始用于细胞的体内清除,包括：通过转基因技术在靶细胞中表达C aspase-3或 Caspace-8来促使靶细胞凋亡、在靶细胞表面表达单疱疹病毒1胸苷激酶(Herpes simplex virus 1 thymidine kinase, HSVtk)或者白喉毒素(Diphtheria toxin, DT)受体(DT receptor, DTR),再用核苷类似物或DT毒素在小鼠体内清除靶细胞。虽然这些方法大大提高了体内清除靶细胞的效率,但仍然存在不可忽视的弊端。通过转基因表达Caspase-3或Caspase-8诱导靶细胞凋亡对实验动物仍然存在毒性,而且清除靶细胞的速率很低。HSVtk转基因小鼠模型只能用于清除进行分裂的细胞,而对于未进行分裂的细胞不适用。DT/DTR介导的细胞清除是近二十年来应用最广泛的模型,但DT本身的毒性作用导致它的药理学安全窗口很窄,在实际研究中很难进行剂量依赖性细胞清除研究。故迫切需要建立一种更有效、简便和安全窗口大的细胞清除方法。中间链球菌毒素(Inrermedilysin, ILY)是一种由中间链球菌分泌的胆固醇依赖性细胞溶解素。可通过和细胞表面的人补体调节蛋白CD59分子特异结合发生多聚化,然后在细胞膜上形成细胞毒性孔道来裂解人的细胞。由于ILY仅选择性结合人的CD59 (human CD59, hCD59),而不结合其他种属的CD59,故对动物来说是很安全的。我们实验室在前期研究中已经发现ILY在hCD59转基因小鼠体内可选择性有效清除表达hCD59的红细胞和内皮细胞。提示hCD59联合ILY对细胞的杀伤可以成为一种新的动物体内细胞清除方法。但如何利用简单的方法建立多种靶细胞特异表达hCD59的转基因小鼠,以便利用ILY选择性清除靶细胞、使这种模型有更广泛的应用价值,成为亟待解决的问题。Cre是一种噬菌体的重组酶,它可以通过识别两个邻近的LoxP位点对位点间的基因序列进行环化切除,已被广泛应用于条件性基因敲除或条件性敲入小鼠的制备。如果能建立带有LoxP的hCD59转基因小鼠,将可利用现有的千余种细胞特异性表达Cre的转基因小鼠,制备出依赖Cre表达调控细胞特异性表达hCD59的转基因小鼠,进而用ILY方便地选择性清除多种靶细胞。因此本论文的目标为：1.制备LoxP-hCD59转基因小鼠(ihCD59、鼠),并通过与细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠(Cre+小鼠)杂交,获得细胞特异性表达hCD59的双转基因小鼠(Cre+ ihCD59+小鼠)。2.通过注射ILY在生理条件下和不同疾病模型中检测其对小鼠体内多种靶细胞的清除效果,研究其在细胞再生、修复和疾病研究中的应用。方法一, LoxP-Stop-LoxP-hCD59小鼠和细胞特异性表达人CD59转基因小鼠的制备(一) Lox-Stop-Lox-hCD59重组表达载体的构建1.制备Cre条件性表达hCD59载体通过将hCD59开放读码框插入CAG启动子及两端有LoxP位点的STOP转录终止元件(LSL)的下游,得到pCAG-LSL-hCD59载体。2.体外验证pCAG-LSL-hCD59载体的Cre依赖性在NIH 3T3细胞中共转染pCAG-LSL-hCD59载体和Cre重组酶表达载体(Cre+)或者单独转染pCAG-LSL-hCD59载体(Cre-),转染48小时后用hCD59荧光染色检测细胞表面hCD59分子表达情况。(二)LSL-hCD59转基因小鼠(ihCD59小鼠)的制备利用TARGATT技术,把CAG-LSL-hCD59的载体序列和体外转录得到的mRNA混合物通过TARGATTTM技术显微注射入80个FVB遗传背景的受精卵前核中,然后这些受精卵被移植入四只CD1培育小鼠体内。通过TARGATTTM载体上的attB位点和染色体上的attP位点之间的遗传重组,转基因CAG-LSL-hCD59被整合在H11位点。显微注射后共得到了23只子代小鼠,利用PCR检测小鼠基因组DNA中是否成功整合了LSL-hCD59序列。(三)系统表达Cre和hCD59双转基因小鼠的制备1.获得系统表达hCD59的Meox2Cre+ihCD59+小鼠将ihCD59小鼠与系统表达Cre的Meox2Cre+小鼠杂交。在子代小鼠中通过基因鉴定得到基因组表达hCD59的Meox2Cre+ihCD59+双转基因小鼠和没有hCD59表达的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(双转基因小鼠中的+代表+/-杂合子)。2.检测Meox2Cre+ihCD59+小鼠体内hCD59在各个器官的表达通过流式细胞术和免疫组织化学染色确定hCD59在Meox2Cre+ihCD59+小鼠的循环系统和各器官中的表达情况。以Meox2Cre-ihCD59+小鼠和C57BL/6小鼠作为对照。(四)多种细胞特异性表达Cre和hCD59的转基因小鼠的制备1.T细胞、髓系细胞和树突状细胞特异表达hCD59转基因小鼠的制备1)通过杂交诱导hCD59在T细胞、单核细胞和树突状细胞表达：为了使hCD59特异的表达在T细胞、单核细胞和树突状细胞中,首先将ihCD59小鼠与多个Cre特异表达的小鼠杂交,包括LckCre+小鼠、LyzCre+、鼠和(CD11cCre+、鼠。通过基因鉴定在子代小鼠中得到hCD59表达阳性的Cre+ihCD59+双转基因小鼠。2)检测hCD59的表达特异性：通过流式细胞术检测hCD59在各个子代Cr+ihCD59+双转基因小鼠品系外周血中的表达。2.肝脏细胞和胆管上皮细胞特异表达hCD59的转基因小鼠系的制备1)用多个方法诱导hCD59特异的在肝细胞和胆管上皮细胞中表达：①用ihCD59小鼠和AlbCre+小鼠杂交使hCD59在子代小鼠的肝细胞和胆管上皮细胞中同时表达。②用Alb启动子调控的腺病毒表达载体Ad-AlbCre+感染ihCD59小鼠使hCD59在小鼠肝细胞中表达。③用ihCD59小鼠和tamoxifen诱导性5ox9creERT+小鼠杂交使hCD59在子代小鼠的胆管上皮细胞中表达。2)检测hCD59在肝脏细胞中的表达：用hCD59抗体和胆管上皮细胞标志分子CK19进行免疫荧光染色检测,检测肝细胞和胆管上皮细胞中hCD59的特异表达。3.星形胶质细胞特异表达hCD59的转基因小鼠的制备1)制备有hCD59表达的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠：用ihCD59小鼠和mGFAP-Cre+、鼠杂交,通过基因鉴定得到hCD59表达的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠。2)检验hCD59在星型胶质细胞中的特异表达：对mGFAP-CreihCD59+小鼠的脑冰冻切片进行GFAP和hCD59的免疫荧光共染色,确定hCD59在星形胶质细胞中的特异表达。二、ILY/ihCD59介导的靶细胞清除方法在生理和病理条件下的应用(一)ILY的制备及活力测定和药理学特性的测定1.ILY的表达、纯化及活性检测1)将装载有重组ILY的表达载体转染到XL1-blue大肠杆菌中。用TB培养基摇菌,待培养液OD600达到0.5左右时加入IPGT诱导蛋白质大量表达。过夜培养后通过离心将菌体收集。2)用裂解液结合高速离心裂解大肠杆菌,通过His亲和柱分离纯化大肠杆菌裂解液中带有His标记的重组ILY。3)将含洗脱的ILY加到内毒素亲和柱上,按照说明书滤出的即为无内毒素的ILY。4)将ILY加入透析膜进行透析48小时去除洗脱液。5)用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定ILY浓度,以已知浓度的BSA标准液作为参照。6)体外红细胞溶血实验检测提纯的ILY的活性,用热灭活ILY作为对照。2.检测ILY的药理学特征用高于实验浓度十倍到二十倍的ILY及热灭活的ILY分别注射ihCD59小鼠,确定ILY的药理学特性,检测注射后不同组织中ILY的分布以及对动物体是否具有毒性。3.检测胆固醇对ILY作用的影响方法同红细胞溶血实验,在反应体系中加入不同浓度的胆固醇(100ug/ml至1600ug/ml).(二)在生理状态下ILY对靶细胞的清除1.生理状态下ILY对免疫系统靶细胞的清除1)分离LckCre+ihCD59+小鼠的脾脏细胞并在体外进行ILY孵浴,用流式细胞术检测ILY在体外对hCD59阳性细胞的杀伤效果。2)分别给予LckCre+ihCD59+小鼠、LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠单次或多次ILY尾静脉注射(75ng/g小鼠体重),通过流式细胞术和免疫荧光染色检测相应小鼠中T细胞、单核细胞和树突状细胞在外周循环系统、脾脏和胸腺中的清除效果。3)检测高浓度ILY(150ng/g和300ng/g)对LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠体内靶细胞的清除。4)检测单次ILY杀伤LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠体内靶细胞后,靶细胞在外周循环系统和脾脏中的恢复情况。5)检测ILY对LyzCre+ihCD59+小鼠肝脏中巨噬细胞和枯否细胞的杀伤和细胞损伤后的修复。2.生理状态下ILY对实质器官中细胞的清除及细胞清除后再生的影响1)在不同小鼠系中检测ILY对肝细胞和胆管上皮细胞的清除对AlbCre+ihCD59+小鼠(肝细胞和胆管上皮细胞均表达hCD59). Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠(肝细胞表达hCD59)和经tamoxifen诱导过的Sox9Cre+ihCD59+小鼠(胆管上皮细胞表达hCD59)进行ILY尾静脉注射,并测量小鼠血清中ALT和胆红素变化。2)检测肝细胞和胆管上皮细胞受损后的修复在ILY注射40h后收集小鼠肝脏,通过BrdU染色检测各个小鼠系中肝细胞和胆管上皮细胞的增殖。3)利用ILY对小鼠肝细胞和胆管细胞的有效清除模拟了慢性损伤模型,对AlbCre+ ihCD59+小鼠、Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠和Sox9Cre ERT+ihCD59+小鼠分别进行了为期9天的多次ILY尾静脉注射(150ng/g,每三天注射一次),在最后一次ILY注射48小时后收集各组小鼠器官,用免疫组化染色检测肝细胞和胆管上皮细胞的增殖。(三)ILY/ihCD59介导的靶细胞清除在研究病理机制方面的应用1.免疫细胞清除与急性肝损伤1)清除DC细胞对α-GalCer诱导急性肝损伤的影响对CD11cCre+ ihCD59+小鼠进行尾静脉注射ILY或PBS,1小时后用a-Galcer诱导肝损伤。24小时后检测血清中的细胞因子和ALT变化。2)清除T细胞、B细胞和髓系细胞对Con A诱导急性肝损伤的影响对LckCre+ ihCD59+小鼠,CD19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠进行尾静脉注射ILY或PBS。3小时后用ConA诱导肝损伤。24小时后检测血清中AST和ALT变化以及对肝脏进行HE染色。2.清除T细胞、B细胞和髓系细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响1)建立实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)：用MOG免疫LckCre+ihCD59+小鼠,(:D19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠,诱导EAE发生。(2)ILY清除免疫细胞：免疫小鼠3天后开始对小鼠进行ILY注射,持续17天。每天观察并记录小鼠EAE发病的临床分数,免疫后第17天处死小鼠并观察小鼠脊髓中MBP和神经丝的变化。3.清除星形胶质细胞对中枢神经系统损伤后修复的影响(1)脑损伤模型：用立体定位系统对mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠造成脑损伤,并在损伤局部添加ILY处理杀伤胶质细胞。在损伤后7天收集脑组织进行切片染色,检测胶质细胞的清除水平。(2)脊髓损伤模型：对mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠制造脊髓损伤,用明胶海绵在损伤局部添加ILY处理杀伤胶质细胞。在术后观察小鼠行动力的恢复情况,损伤后7天收集脊髓,检测损伤区域胶质细胞的清除情况。结果一、获得了LoxP-Stop-LoxP-hCD59转基因小鼠(ihCD59小鼠)通过将hCD59开放读码框插入CAG启动子及两端有LoxP位点的STOP终止元件(LSL)下游,得到pCAG-LSL-hCD59载体；利用体外实验证实,转染pCAG-LSL-hCD59载体的NIH3T3细胞仅在共转染Cre重组酶表达载体的情况下,细胞膜表面有hCD59表达；通过Applied Stem Cell Inc公司的TARGATTTM定点敲入技术,把CAG-LSL-hCD59序列插入到FVB/NJ小鼠基因组的Hipp11(H11)位点,获得Cre诱导性表达的Lox-Stop-Lox-hCD59转基因小鼠(Cre inducible hCD59 mice, ihCD59小鼠)。在获得的23只子代小鼠中,通过PCR方法验证hCD59是否整合入小鼠的基因组DNA中。检测后共得到了一只ihCD59雌性小鼠和一只ihCD59雄性小鼠。值得说明的是,ihCD59小鼠为+/+纯合子小鼠。二、获得系统和多种细胞特异性表达Cre和hCD59的双转基因小鼠(Cre+ihCD59+小鼠)(一)获得系统表达hCD59的月eox2Cre+ihCD59+小鼠通过将ihCD59小鼠和系统表达Cre重组酶的Meox2Cre+小鼠杂交,并对子代小鼠进行基因鉴定,得到有hCD59表达的Meox2Cre+ ihCD59+、鼠和没有hCD59表达的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(双转基因小鼠中的+代表+/-杂合子)。通过流式细胞分析术和免疫组织化学染色,发现hCD59在Meox2Cre+ ihCD59+小鼠的所有器官均有表达,而未表达于Meox2Cre-ihCD59+鼠和C57BL/6野生型小鼠中。说明通过ihCD59小鼠和Cre阳性小鼠杂交来获得hCD59表达阳性的子代小鼠是可行的；hCD59小鼠的诱导性hCD59表达在各个器官中非常均一。同时,hCD59在子代小鼠体内的表达严格受到Cre的调控。(二)获得多种细胞特异性表达hCD59的转基因小鼠1.获得T细胞、髓系细胞和树突状细胞特异表达hCD59的转基因小鼠通过将ihCD59小鼠分别与LckCre+小鼠、LyzCre+小鼠和(D11cCre+小鼠杂交,并对子代小鼠进行基因鉴定,使hCD59特异表达在：LckCre+ihCD59+小鼠的T细胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系细胞和CD11cCre+ihCD59+小鼠的树突状细胞中。通过流式细胞术发现hCD59仅在LckCre+ihCD59+小鼠的T细胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系细胞(如单核细胞和中性粒细胞)以及CD11cCre+ihCD59+小鼠的树突状细胞中特异表达。2.获得肝脏细胞和胆管上皮细胞特异表达hCD59的转基因小鼠系用ihCD59小鼠和Albcre+小鼠杂交,在子代获得hCD59在肝细胞和胆管上皮细胞同时表达的AlbCre+CD59+小鼠；用Alb启动子调控的腺病毒表达载体Ad-AlbCre感染ihCD59小鼠,得到Ad-AlbCre+ihCD59小鼠；用ihCD59、鼠和Sox9CreERT+小鼠杂交,并通过对子代Sox9CreERT+ihCD59+小鼠进行tamoxifen诱导,使hCD59在子代小鼠的胆管上皮细胞中表达。免疫荧光染色表明hCD59仅在AlbCre+ihCD59+小鼠的肝细胞和胆管上皮细胞中表达；在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠的肝细胞表达;在sox9CreERT+ihCD59+小鼠的胆管上皮细胞表达。3.获得星形胶质细胞特异表达hCD59的转基因小鼠通过对mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脑冰冻切片进行GFAP和hCD59的免疫荧光共染色,我们发现hCD59只特异的表达在小鼠神经胶质细胞中。三、ILY/ihCD59介导的靶细胞清除方法在生理和病理条件下的应用(一)ILY的制备及活力测定和药理学特性测定1.ILY的产出、纯化及活性检测：ILY在大肠杆菌中大量表达后,通过His亲和柱纯化,获得纯度高、不含内毒素且具有活性的ILY。用热灭活ILY和高于实验剂量二十倍的ILY对ihCD59小鼠进行一次或多次注射,均未发现高剂量ILY对小鼠血常规指标和各个器官组织结构功能有任何影响。另外,发现在体外100ug/ml到1600ug/ml的外源胆固醇对ILY介导的细胞裂解无影响,为在高脂环境下应用ILY清除靶细胞奠定了基础。(二)在生理状态下ILY对靶细胞的清除1.生理状态下ILY对免疫系统靶细胞的清除1)ILY在体外成功杀伤了LckCre+ihCD59+小鼠的脾脏细胞中hCD59阳性的T细胞,而没有影响B细胞。2)对小鼠进行一次ILY尾静脉注射可以分别有效清除LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠外周血中的T细胞和单核细胞。ILY还可以分别清除CD11cCre+ihCD59+小鼠脾脏中的树突状细胞和LckCre+ihCD59+小鼠脾脏中的T细胞。并且,ILY在体内对hCD59阳性细胞的杀伤作用存在ILY剂量依赖性。提高注射的ILY浓度可以一定程度的增加靶细胞被清除的效果。3)检测了各种免疫细胞被单次ILY注射杀伤后的恢复再生情况。结果显示,LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠的外周血T细胞和单核细胞在ILY注射0.1小时后就可以被清除达90%,注射后24小时恢复到正常水平。同时发现单核细胞被清除后,Ly6C-细胞恢复的速度比Ly6C+细胞慢。LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠脾细胞中的T细胞和树突状细胞在ILY注射后24h也可恢复到正常水平。而对小鼠进行多次ILY注射可以将靶细胞水平长时间维持在较低的水平。4)ILY注射有效清除了L yzCre+ihCD59+小鼠肝脏局部F4/80阳性枯否细胞和巨噬细胞。BrdU标记显示经ILY杀伤后枯否细胞明显发生增殖。我们对C57BL/6小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠进行GFP标记的单核细胞移植。在正常状态下,移植后的C57BL/6小鼠肝脏中并不存在GFP阳性细胞。而经过ILY注射的LyZCre+ihCD59+小鼠中,1.5%的枯否细胞表现为GFP阳性。说明在枯否细胞被急性清除状态下,单核细胞参与了肝脏枯否细胞的再生。这一实验也说明ihCD59模型是研究免疫细胞分化和再生的有效工具。2.生理状态下ILY对实质器官中细胞的清除及细胞再生的影响1)ILY对肝细胞和胆管上皮细胞的清除：在对AlbCre+ihCD59+小鼠(肝细胞和胆管上皮细胞均表达hCD59)、Ad-AlbCre+ihCD59小鼠(肝细胞表达hCD59)和经tamoxifen诱导过的Sox9CreERT+ihhCD59+小鼠(胆管上皮细胞表达hCD59)进行ILY注射后,我们通过免疫染色发现ILY注射可以引发AlbCre+ihCD59+小鼠体内显著的肝组织损伤和胆管损伤。同时,肝损伤的程度呈现ILY浓度依赖性。在Ad-AlbCre+ihCD59小鼠中,ILY注射仅会引发肝细胞损伤。对经过tamoxife诱导的sox9CreERT+ihCD59+小鼠进行ILY注射会引起小鼠胆管损伤。2)肝细胞和胆管细胞的清除后再生：研究还发现ILY在AlbCre+ihCD59+小鼠引起肝细胞和胆管上皮细胞损伤40小时后,可以检测到肝脏有明显的肝细胞和心管上皮细胞的增殖。但是在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠中特异清除肝细胞40小时后仅能检测到肝细胞增殖；而在Sox9CreERT+ihCD59+小鼠特异清除胆管上皮细胞后则可以检测到肝细胞和胆管上皮细胞均有增殖。同时,我们还对AlbCre+ihCD59+小鼠进行多次ILY注射。发现慢性肝细胞和胆管上皮细胞损伤引发了肝脏纤维化,在纤维化部位还检测到了肝脏祖细胞。但是只损伤肝细胞或者胆管上皮细胞则不会引起纤维化和肝脏祖细胞产生。(三)ILY/ihCD59介导的靶细胞清除在多种疾病模型中的应用1.清除T细胞、B细胞和髓系细胞对急性肝损伤的影响1)利用α-Galcer诱导的肝损伤模型：我们发现在CD11icCre+ihCD59+小鼠中用ILY清除树突细胞可以显著缓解α-Galcer诱导的NKT细胞引发的急性肝损伤。2)利用Con A诱导的肝损伤模型：我们发现在LcCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中,ILY介导的T细胞和单核细胞清除都可以缓解甚至阻止ConA诱导的急性肝损伤。但是在CD19Cre+ihCD59+小鼠中清除B细胞则没有对ConA诱导的急性肝损伤产生影响。2.清除T细胞、B细胞和髓系细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响采用EAE来验证ihCD59模型是否适用于研究慢性免疫性疾病中各免疫细胞的功能。实验结果显示,用ILY在LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中分别清除T细胞和单核细胞可以显著抑制小鼠髓鞘受损程度,缓解EAE的发生,而在在CD19Cre+ihCD59+、鼠中清除B细胞则对疾病发生没有明显作用。3.清除星形胶质细胞对中枢神经系统损伤后修复的影响1)利用脑损伤模型,我们发现在mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脑损伤部位局部注射ILY可以清除损伤活化的星形胶质细胞,而尾静脉注射ILY对星形胶质细胞的清除效果有限。2)利用脊髓损伤模型,我们发现在,nGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脊髓损伤局部施加ILY处理也起到了消除反应性星形胶质细胞的作用。星形胶质细胞被清除的小鼠存在体重下降和活动能力恢复缓慢的现象。结论1.ihCD59/ILY介导的细胞清除方法可以特异、快速地清除体内靶细胞本研究成功建立了Cre条件性表达hCD59的转基因小鼠(ihCD59小鼠),通过与不同品系的细胞特异性Cre转基因小鼠杂交,使hCD59特异表达在子代小鼠的靶细胞中。对子代小鼠进行ILY注射可以实现对靶细胞的体内清除。肝脏细胞和胆管上皮细胞清除模型实验显示,ILY可以特异的在短时间内分别清除肝细胞和胆管细胞,而没有引起任何非目标效应。更重要的是,研究发现\LYIihCD59介导的细胞清除存在ILY剂量依赖性。2. ihCD59/ILY介导的细胞清除方法可以被用于研究不同细胞在生理和疾病状态下的功能ILY单次注射和多次注射可以引起短期的和长期的靶细胞清除,成为研究细胞再生以及细胞在急性疾病模型(如急性肝损伤和中枢神经系统局部创伤)或慢性病理过程(如EAE)中功能的有力手段。3.ILY具有很大的使用剂量范围我们的实验表明比清除细胞的剂量高十到二十倍剂量的ILY对小鼠都是安全有效的,不会引起任何非靶细胞杀伤效应,对实验生物体也不存在毒副作用。创新性和意义本研究成功利用ILY和hCD59之间特异的相互作用,结合Cre重组技术实现了可诱导性的对多种细胞进行体内清除。与现存的其他细胞清除模型相比,ILY/ihCD59介导的细胞清除具有以下优点：1.ILY介导的细胞杀伤更加迅速：ILY可以通过与hCD59特异结合,在数秒内对细胞膜穿孔进而裂解细胞,实现对靶细胞的清除。2. ILY/ihCD59介导的细胞清除特异性更强：ILY只会结合hCD59,杀伤表达hCD59的细胞,而不会结合除人类之外其它生物的hCD59分子。因此,即使大量提高ILY的使用剂量也不会对其他非hCD59表达细胞产生影响。3.ILY具有很宽的药理学安全窗口：基于ILY裂解细胞的特异性高,比有效清除靶细胞的剂量高十到二十倍剂量的ILY对实验动物都是安全的,不会引起任何非靶细胞杀伤效应,对实验生物体本身不具有任何毒副作用。4.ILY介导的体内细胞杀伤具有明显的浓度依赖性：不同剂量的ILY可以引起不同程度的hCD59阳性靶细胞杀伤,这使ILY/ihCD59介导的细胞清除方法可以被用于需要不同程度清除细胞的研究。5.ILY的处理实施方便：在实验中,通过尾静脉注射、腹腔注射、皮下注射和局部作用等方法对实验动物进行ILY给药,都可以发挥很好的细胞杀伤作用。ILY的给药方式取决于靶细胞存在部位及状态,选择灵活。研究局限性ILY作为一个小分子蛋白质,在生物体内的扩散有限,在一定程度上受到体内屏障系统的限制。我们的研究结果显示ILY可以更有效的杀伤绝大部分外周血中的细胞,清除部分实质器官中的细胞,而对胸腺,骨髓和和中枢神经系统细胞杀伤效果有限。目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是脂质代谢异常诱导的血管壁的慢性炎症,是多种心血管疾病(如,冠脉综合征和脑中风)的病理基础,严重危害人类的健康。已知多种免疫细胞,特别是巨噬细胞在AS斑块的发生和进展中发挥重要作用。在动脉粥样硬化的早期,血液中的脂质成分通过受损的内皮细胞进入血管壁,进而诱发血液中的单核细胞迁入血管壁,活化成为为巨噬细胞,吞噬和清除脂质,以减少斑块的形成。随着病程的进展,如果脂质过多,过度荷脂的巨噬细胞会变成泡沫细胞,释放大量的炎性细胞因子和生长因子,促进斑块的发展和不稳定性斑块的形成,因此,抑制泡沫巨噬细胞的形成对减少斑块的大小和改进斑块的稳定性有重要价值。新近研究提示细胞自稳或死亡的新形式-自噬(utophagy)调控巨噬细胞的功能、影响斑块的不稳定性。自噬是真核生物进化中高度保守的对细胞内物质进行降解再利用的过程。细胞内的可溶性分子(异常折叠的蛋白和脂质)和受损老化的细胞器都可以被包裹进入囊泡,这种囊泡被称为自噬体。自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体,利用溶酶体中的水解酶将自噬体包裹的物质分解,帮助细胞达到生存产物的合成、降解以循环利用间的平衡。已知自噬参入动脉粥样硬化斑块的发生和发展,特别是发现基础的的巨噬细胞的自噬可抑制动脉粥样硬化的发生和发展,巨噬细胞可通过脂自噬促进脂滴的降解,促进胆固醇外排,从而抑制泡沫巨噬细胞的形成,抑制动脉粥样硬化的发生和发展。故自噬已经成为抗动脉粥样硬化药物研发的新靶点并已有相关药物进入临床。因此寻找能通过调控自噬水平的制剂,有可能成为新的抗动脉粥样硬化的药物。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)的抑制剂,由于它在饥饿时能通过抑制III型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class ⅢP13K)的活性而抑制自噬,故在体外常作为自噬的抑制剂被广泛使用。但有研究显示,在营养丰富的条件下,3-MA的长时间作用,也可以抑制I型磷脂酰肌醇三磷酸(Class IPI3 K)促进细胞发生自噬。研究结果表明,3-MA在体内通过抑制自噬减轻了大鼠实验性自身免疫神经炎的发病及控制肠道病毒71的感染和疾病发生。3-MA对高脂诱导的动脉粥样硬化有何影响?是通过抑制自噬还是促进自噬发挥作用,尚不清楚。故本选用3-MA和另一种自噬抑制剂LY294002对动脉粥样硬化进行了干预,具体的研究的目的是：一、研究小鼠体内3-MA应用对高脂诱导的动脉粥样硬化的影响；二、探索3-MA影响动脉粥样硬化形成和发展的可能机制(抑制自噬或促进自噬或有其他作用)方法一、研究3-MA在动脉粥样硬化中的作用(一)动脉粥样硬化斑块的诱导和3-MA干预1.第一次干预治疗实验：将18只8周龄ApoE-/-小鼠随机分成三组,每组6只小鼠：1)3-MA干预组(30mg/kg, Sigma,依据文献[31])；同时以另一种自噬的抑制剂LY294002作为干预对照组(0.3mg/kg, Sigma,依据文献[32])；PBS对照组小鼠。2)通过腹腔注射对小鼠进行相应的干预治疗,每周两次,共进行8周。3)最后一次注射结束后一周对小鼠进行解剖,收集心脏和主动脉。2.第二次干预治疗实验：根据第一次干预治疗的结果将18只8周龄ApoE-/-小鼠随机分为两组：3-MA治疗组(10只)和PBS对照组(8只),按照第一次治疗的方式重复实验。(二)检测3-MA对动脉粥样硬化斑块形成和发展的影响1.收集所有小鼠的主动脉,将主动脉的内壁充分暴露后进行油红O染色,分析阳性染色的主动脉斑块占主动脉总面积的比例。2.取小鼠主动脉根部制作成厚度为7um的连续冰冻切片,通过HE染色和油红O染色分析主动脉根部斑块的大小和脂质成分比例。3.通过对主动脉根部冰冻切片进行CD3、Moma-2、smc免疫组化染色和天狼星红染色检测斑块中的炎性细胞浸润情况和斑块组成。4.通过TUNEL染色检测斑块中的凋亡细胞。5.通过公式计算小鼠的斑块易损因子。二、研究3-MA抑制动脉粥样硬化形成和发展的可能机制(一)检测3-MA在高脂环境对自噬的影响1.在体外,为了模拟体内动脉粥样硬化发生的过程,我们的对小鼠腹腔分离的巨噬细胞添加ox-LDL刺激。在添加ox-LDL刺激的同时,我们将细胞分为三个实验组：ox-LDL单独刺激组,3-MA预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组,雷帕霉素(Rap)预处理30分钟后添加ox-LDL联合刺激组。在各组添加刺激后的24、48和72小时分别收集细胞,提取细胞蛋白进行Western blot检测自噬标记蛋白LC3和p62的表达水平。2.对小鼠主动脉根部的冰冻切片进行LC3免疫荧光染色,检测斑块中的自噬水平。(二)检测3-MA对巨噬细胞泡沫化和存活的影响1.用小鼠主动脉根部的冰冻切片进行脂滴和LC3免疫荧光共染,分析斑块中脂质成分和自噬体分布的关系。2.在体外,将小鼠腹腔巨噬细胞分成两个实验组：ox-LDL单独刺激组,3-MA预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组。在各组添加刺激后的24、48和72小时分别对各组细胞进行油红O染色,统计油红O染色为阳性的泡沫细胞占总细胞数量的比例。3.在体外,将小鼠腹腔巨噬细胞分成两个实验组：ox-LDL单独刺激组,3-MA预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组、Rap预处理30分钟后添加ox-LDL刺激组。用CCK-8检测各组添加刺激后的24、48和72小时的细胞存活率。(三)检测3-MA对斑块局部细胞因子的影响提取小鼠主动脉的总RNA,逆转录成cDNA后进行real-time PCR,检测主要炎性和抑炎性细胞因子的表达情况,包括IL-17、IFN-yγ、IL-6、 TGF-(3、IL-10、IL-35的亚基IL-12αr和Ebi3及其相关亚基IL-1213和p28。还检测了Treg细胞的标志Foxp3的表达。结果一、研究3-MA抑制动脉粥样硬化斑块的形成并促进了斑块的稳定性,但另一个自噬抑制剂LY294002无作用(一)3-MA抑制了动脉粥样硬化的形成1.由于3-MA的水溶性差,常规体外实验采用DMSO溶解。为了克服DMSO的毒副作用,本研究采用PBS加热溶解3-MA的方法,制备了低浓度水溶性3-MA,实验证明这种水溶性3-MA不仅不损伤肝肾功能,还降低了小鼠血清中的AST水平。2.通过主动脉大体的油红O染色,我们发现3-MA处理组小鼠主动脉中的动脉粥样硬化斑块显著少于PBS对照组小鼠,但LY294002处理组小鼠与对照组比较无明显差异。3.对主动脉根部冰冻切片进行HE染色表明,与PBS对照组小鼠对比,3-MA处理组小鼠主动脉根部的动脉粥样硬化斑块面积明显减小。但LY294002处理组小鼠与对照组无明显差异。4.对主动脉根部冰冻切片进行油红O染色显示,3-MA处理组小鼠主动脉根部斑块中脂质成分明显低于对照组,但LY294002作用不明显。(二)3-MA对动脉粥样硬化斑块稳定性具有促进作用1.通过对主动脉根部进行相应的免疫组化染色我们发现,3-MA对T细胞浸润没有显著影响,但是明显降低了巨噬细胞在斑块中的比例,对斑块中平滑肌细胞的比例也有一定程度的减少。天狼猩红染色显示3-MA处理组小鼠斑块局部的胶原成分高于PBS对照组。TUNEL染色显示3-MA处理显著减少了小鼠斑块中的凋亡细胞数量和坏死核心面积。2.通过计算和统计发现3-MA处理组小鼠的斑块易损因子明显低于PBS对照组小鼠。但LY294002对斑块稳定性影响不大。二、研究3-MA抑制动脉粥样硬化形成和发展的可能机制(一)体外3-MA长时间处理促进ox-LDL诱导的巨噬细胞自噬、减少泡沫胞形成并降低巨噬细胞活力体外实验结果显示用ox-LDL诱导腹腔巨噬细胞泡沫化的同时用3-MA长时间处理(24、48和72小时)会显著增加自噬标志分子LC3的表达,同时作为自噬底物的p62分子会明显降低,说明3-MA3-MA长时间处理可促进ox-LDL诱导的巨噬细胞自噬。同时,发现3-MA可抑制ox-LDL诱导的泡沫巨噬细胞的形成和减低泡沫巨噬细胞的活力。说明在高脂环境下,3-MA可通过促进自噬,促进减少泡沫巨噬细胞形成和促进自噬介导的细胞死亡。(二)3-MA干预显著降低了脂滴成分小鼠体内实验显示斑块局部脂滴减少,残留的自噬阳性的巨噬细胞减少。采用免疫荧光染色检测小鼠主动脉斑块中脂滴和LC3阳性自噬体的水平,发现3-MA处理组小鼠斑块中自噬体少于PBS对照组小鼠。但是3-MA处理显著降低了小鼠斑块中的脂滴成分。同时我们发现脂滴主要积累在LC3染色阴性的区域,而自噬体较多的LC3阳性区域的脂滴明显减少。提示我么自噬有助于脂质的代谢排出。但是用Western blot检测LC3在小鼠主动脉中的表达,发现3-MA处理组小鼠主动脉壁中的LC3在蛋白水平要低于PBS对照小鼠,同时I型P13K通路在3-MA处理组也低于PBS对照组。结合体外实验,提示3-MA干预可能通过促进自噬有助于脂质代谢,并且最终引起巨噬细胞的自噬性死亡和清除。(三)3-MA干预促进了炎症抑制性因子表达Real-time PCR显示3-MA促进了小鼠主动脉血管壁中的抑炎性细胞因子IL-10、 TGF-β口IL-35的表达,而对促炎性细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平没有明显的影响。考虑到调节性T细胞是主要的免疫负调控性细胞,我们也检测了调节性T细胞的标志分子Foxp3的表达水平,发现3-MA处理组小鼠的Foxp3在转录水平明显高于对照组小鼠,提示3-MA具有改善斑块局部抗炎微环境的作用。结论一、3-MA对动脉粥样硬化有显著地抑制作用本研究证实3-MA显著减小了高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉大体和根部的斑块面积,并且显著减少了斑块中的脂质成分。二、3-MA促进了动脉粥样硬化斑块的稳定性3-MA有效增加了动脉粥样硬化斑块纤维帽区域的平滑肌细胞,并且减少了斑块中浸润的巨噬细胞和坏死细胞。3-MA处理组小鼠的斑块易损系数明显低于对照小鼠。以上现象均表明3-MA显著促进了动脉粥样硬化斑块的稳定性。三、3-MA通过增强自噬水平,抑制巨噬细胞泡沫化并促进其死亡在高脂环境中,3-MA长时间处理促进了自噬的发生,从而有利于斑块区域泡沫化细胞中的脂质外排。3-MA还会影响高脂环境中巨噬细胞的存活率,在有效抑制细胞凋亡的状态下,可能诱导巨噬细胞的自噬性死亡,从而导致斑块中巨噬细胞的数量减少。四、3-MA可以促进斑块局部抗炎性细胞因子的表达3-MA在体内可以提高抗炎性细胞因子的水平,包括IL-10、TGF-β和IL-35,同时对Foxp3的表达水平也有促进,有助于维持斑块局部的抗炎微环境。创新性和意义1.本实验第一次在小鼠动脉粥样硬化模型中研究了3-MA长期作用对动脉粥样硬化的影响。2.本实验确定了低浓度溶解于PBS中的3-MA对实验动物不存在毒副作用,反而对高脂喂养的小鼠具有保护作用,使3-MA及其衍生物成为研发治疗动脉粥样硬化药物的新靶点。研究局限性1.本实验选用的LY294002并没有对动脉粥样硬化疾病的发展起到显著作用,有可能是因为选用的体内治疗浓度不合适本次实验。应选用不同浓度的LY294002和3-MA确定它们在体内对动脉粥样硬化的作用。2.鉴于自噬在动脉粥样硬化发生早期和后期的活化水平和对细胞的影响可能不同,应该分阶段研究3-MA在动脉粥样硬化早期和后期的功能是否相同。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543
，

本文编号：1612094