miR-17通过靶向mitofusin 2调控缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡

发布时间：2018-03-16 20:02

本文选题：低氧诱导　切入点：肺动脉高压　出处：《郑州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种与肺血管痉挛、肺血管重塑及肺血栓形成导致的肺血管阻力增加紧密相关的异常血流动力学疾病,若未及时治疗,病情进行性发展可发生右心衰竭而死亡。其发病机制涉及细胞异常、分子介质和遗传因素等多个途径,肺血管内皮细胞功能受损、肺血管收缩反应增强和血管重建、炎症和免疫失调等参与形成,多种血管活性物质失衡促进其发生。低氧性肺动脉收缩(hypoxic pulmonary artery vasoconstriction,HPV)和低氧性肺血管重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling,HPVR)是PAH的主要病理生理变化,特别是肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的增殖起了重要的作用,尽管PAH发病机制未完全明确,目前增殖与凋亡的失平衡(尤其是PASMCs)越来越受到重视,并成为研究的热点。微小RNA(micro RNA,miRNA)是在真核细胞中广泛存在的非编码、高度保守、单链、小分子RNA(长度约22个氨基酸),能够通过完全和(或)部分互补的原则结合靶基因m RNA的3’UTR区域碱基调控靶基因的表达,从而参与调控个体发育、分化、增殖及凋亡等生命活动。人类基因组中有300多个miRNA基因簇,miR-17家族又叫miR-106b家族,是由6个序列相似、结构相仿、种子序列相同(AAAGUGCU)、物种间高度保守的成熟体miRNA组成,许多研究表明其中miR-17家族由于参与哺乳动物心、肺、免疫系统等器官发育并与实体肿瘤的发生紧密相关而受到广泛关注。线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)是线粒体融合蛋白家族的成员,不仅是维持线粒体正常形态和发挥必要分子特征的重要元素,同时还具有调节细胞增殖、分化、凋亡和信号转导等功能的作用,研究发现Mfn2可以抑制PI3K/Akt信号通路,使线粒体外膜通透性增高,激活线粒体凋亡途径,促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells VSCMs)凋亡。Mfn2在心血管疾病中对VSCMs增殖发挥重要作用且被深入研究,那么其对低氧性肺动脉高压中PASMCs是否具有同样作用还不清楚。近年来有研究发现miR-17可通过PDLIM5或BMPR2等下调miR-17的表达来调控细胞的增殖或凋亡,参与肺动脉平滑肌细胞的调控,从而导致肺动脉高压的发生。然而miR-17在肺动脉高压疾病中参与的研究多是动物模型水平,miR-17及Mfn2在低氧诱导的动物肺动脉高压模型中发挥着重要作用,然而miR-17是否可以通过靶向调节Mfn2在人离体肺动脉平滑肌细胞模型等临床研究中发挥作用并未报道。因此,我们推测miR-17的表达下调可能通过靶向调节Mfn2的表达从而抑制PASMCs的增殖并延缓肺动脉高压的发生。目的该课题拟以肺动脉高压患者的肺组织标本和低氧诱导肺动脉平滑肌细胞为材料,模拟PAH的慢性缺氧过程,通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)分别检测miR-17和Mfn2蛋白在肺动脉高压(PAH)患者肺组织及正常肺组织中的表达水平,通过双荧光素酶报告实验验证miR-17与靶基因的作用位点,探索miR-17及其靶基因对缺氧PASMCs的增殖、凋亡及相关蛋白的影响。方法1.为了模拟PAH的慢性缺氧过程,我们把PASMCs在低氧(即3%O2、5%CO2、92%氮气)的条件下培养48 h,然后收取细胞,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western Blot技术检测正常和缺氧处理的PASMCs miR-17和Mfn2表达水平。2.在缺氧处理的PASMCs中,运用脂质体转染技术转染化学合成的anti-miR-17和anti-miR-NC,在低氧条件下培养48 h后收取细胞进行q RT-PCR实验检测miR-17表达水平,通过噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖活性,进行western blot实验检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell Nuclear Antigen,PCNA)的表达情况;进行流式细胞术检测肺动脉平滑肌细胞凋亡情况,并且检测凋亡相关蛋白Caspase-3的活性,研究miR-17表达抑制对肺动脉平滑肌细胞细胞增殖、凋亡的影响。3.在肺动脉平滑肌细胞转染miR-NC、miR-17 mimics、anti-miR-NC和anti-miR-17,48 h后收取细胞,荧光素酶报告基因实验验证miR-17和Mfn2m RNA3’UTR的结合情况,运用western blot检测miR-17 mimics、anti-miR-17对Mfn2蛋白表达的影响。为了进一步验证miR-17对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡的调控机制,我们在肺动脉平滑肌细胞转染si Mfn2抑制内源性Mfn2蛋白的表达,观察si Mfn2对anti-miR-17增殖抑制和凋亡促进作用的影响,运用western blot检测PCNA以及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果1.和正常肺组织样本相比,miR-17在肺动脉高压患者肺组织中的表达明显增多,而Mfn2蛋白表达水平下调。q RT-PCR和western blot检测结果显示,和常氧处理的肺组织对照组相比,缺氧处理组细胞miR-17表达量上升,Mfn2蛋白表达降低。2.和anti-miR-NC对照组细胞相比,转染anti-miR-17的肺动脉平滑肌细胞增殖活性明显降低。转染miR-17抑制剂anti-miR-17后,PCNA的蛋白表达水平下降。相比anti-miR-NC对照组,anti-miR-17组细胞凋亡率和Caspase-3活性明显升高。3.与共转染miR-NC和Mfn2-3’UTR报告基因载体组相比,共转染miR-17mimics和Mfn2-3’UTR报告基因载体后,萤火虫荧光素酶活性明显降低。与共转染miR-NC和Mfn2-Mut-3’UTR报告基因载体组相比,共转染miR-17 mimics和Mfn2-Mut-3’UTR报告基因载体后,萤火虫荧光素酶活性没有明显变化,miR-17对萤火虫荧光素酶活性的抑制作用消失。转染miR-17 mimics的细胞,Mfn2蛋白表达水平明显降低,而转染anti-miR-17后,Mfn2蛋白表达水平明显上调。在PASMCs转染anti-miR-17和si Mfn2,抑制miR-17和内源性Mfn2蛋白的表达,观察肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡的变化。和anti-miR-NC+si NC组细胞相比,anti-miR-17+si Mfn2组细胞增殖活性降低,增殖蛋白PCNA表达降低,细胞凋亡率和Caspase-3活性上升,凋亡相关蛋白Caspas-3表达升高。结论1.miR-17在缺氧肺动脉平滑肌细胞和肺动脉高压患者肺组织表达上调,而Mfn2表达下调。2.降低miR-17的表达能够抑制低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖,促进肺动脉平滑肌细胞凋亡。3.miR-17通过靶向调控Mfn2基因表达,调控低氧条件下肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡。综上所述,miR-17/Mfn2调控途径是缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞过度增殖和凋亡减少的重要调节机制,miR-17可能成为防治肺动脉高压的潜在治疗靶点。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1

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