PDGFR抑制剂Sunitinib药物涂层支架抑制内膜增生的初步研究

发布时间：2018-03-19 20:21

本文选题：PDGFR抑制剂　切入点：血管平滑肌细胞　出处：《南京大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前言药物涂层支架(Drug eluting stent,DES)已用于冠状动脉治疗,但外周动脉中DES仍处于动物实验和临床试验状态,支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR)和内皮化(re-endothelialization,RE)不全仍是亟需解决的问题。ISR和血管平滑肌增殖所致的内膜增生密切相关,RE不全是由于洗脱药物非特异性的抗增殖的作用,这些药物在抑制血管平滑肌增殖的同时,抑制了血管内皮细胞的生长。因而,有必要设计出新的药物涂层支架,"靶向"抑制血管平滑肌增生的同时,不影响内皮细胞的生长。血小板生长因子(platelet derived growth factor,PDGF),包括 PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D是影响血管平滑肌生长重要的生长因子。PDGF受体(PDGF receptor,PDGFR)是广泛表达于血管平滑肌细胞上的一种细胞因子受体,和平滑肌细胞的增殖和迁徙有密切的关系,但该受体在内皮细胞上却无表达。其中PDGF-B可以结合所有表达在平滑肌细胞上的所有受体(PDGF-R α α,PDGF-Rαβ and PDGF-Rββ),导致PDGF-R的磷酸化,从而激活下游信号通路。因而通过抑制PDGFR的激活来抑制平滑肌增殖成为支架涂层药物的新"靶点"。舒尼替尼(Sunitinib),是络氨酸激酶受体的抑制剂,可明显的抑制PDGF-R的磷酸化,而对VEGF-R、FGF-R和EGF-R的抑制效果微弱。目前Sunitinib主要用于胃间质肿瘤或肾母细胞瘤的靶向药物,其作为支架洗脱药物抑制内膜增生还未被研究。本研究拟合成一种新型药物涂层支架(Sunitinib药物涂层支架),通过体外实验验证该涂层药物对血管平滑肌增殖和迁徙的效果,进而探讨其作用的机制。然后体外合成该药物涂层支架,体外检测其载药性质和血液相容性,最后将该药物涂层支架植入至兔颈动脉内,通过影像学、形态学观察和标本的分子生物学的检测验证该新型药物涂层支架的有效性和安全性。第一部分:PDGFR抑制剂Sunitinib对血管平滑肌细胞增殖和迁徙作用的初步研究目的:体外实验检测药物Sunitinib对血管平滑肌细胞增生和迁徙的影响,探讨Sunitinib作用于平滑肌的分子生物学机制。方法:MTT实验检测药物Sunitinib对大鼠血管平滑肌和内皮细胞的杀伤作用。Annexin V-FITC/PI染色检测Sunitinib对大鼠血管平滑肌凋亡和坏死的影响。细胞划痕实验检测Sunitinib对大鼠血管平滑肌迁徙的影响。免疫荧光检测Sunitinib药物作用后大鼠血管平滑肌α-actin荧光表达。Western Blot法检测Sunitinib作用后平滑肌细胞内p-PDGFR和p-ERK的表达。结果:MTT实验显示Sunitinib可剂量依赖性的抑制血管平滑肌细胞的生长,但对血管内皮细胞的生长在浓度0.1、1μM时无明显抑制作用。Annexin V-FITC/PI染色检测提示Sunitinib是通过促进平滑肌细胞的凋亡和坏死来抑制增殖。细胞划痕实验检测显示Sunitinib可剂量依赖性的抑制平滑肌细胞的迁徙通过抑制平滑肌细胞中α-actin的表达。Western Blot结果显示:Sunitinib可以通过抑制PDGF介导的p-ERK的激活来抑制平滑肌细胞的增殖和迁徙。结论:Sunitinib可特异性的抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁徙通过抑制PDGF介导的p-ERK的激活。第二部分:Sunitinib药物涂层支架的构建和体外相容性的检测目的:体外构建Sunitinib药物涂层支架,检测其载药性质和血液相容性,观察流体力学刺激对种植于支架表面内皮细胞的影响。方法:将金属裸支架浸泡于含药物Sunitinib浓度为2 mg/g聚乙二醇(PEG)凝胶中,构建Sunitinib药物涂层支架,检测其载药剂量及球囊扩张对支架载药量的影响。评价Sunitinib药物涂层支架体外抗凝性质,通过血管平滑肌细胞粘附实验体外观察Sunitinib药物涂层支架对平滑肌细胞的作用。检测Sunitinib药物涂层支架上血管内皮细胞生长情况,将Sunitinib药物涂层支架放入生物反应器反应1、3、5周后,qPCR和Western bolt检测流体力学刺激对种植于支架表面内皮细胞的影响。结果:每个支架所携带的Sunitinib的总量为32±5.4μg,球囊扩张前后支架上所携带的Sunitinib的总量未发生明显的变化。通过电镜观察血小板粘附程度的实验发现:所合成药物涂层支架上未见血小板粘附,提示药物涂层支架抗凝性能良好。检测血管平滑肌细胞的粘附率发现,裸支架每个支架支柱可见21.8±9.3个细胞的粘附,而药物涂层支架,每个支架支柱仅见11.2±5.4个细胞的粘附(21.8±9.3 versus11.2±5.4/支架支柱,p=0.03)。内皮细胞的生长的电镜结果提示:内皮细胞在药物涂层支架上生长良好,排列整齐,在裸支架上生长良好,但排列紊乱。当药物涂层支架生物反应器反应一段时间后,eNOS的蛋白质和mRNA的表达都明显的增高,且升高呈现时间依赖性,提示Sunitinib药物涂层支架在流体环境中反应良好。结论:本实验中体外构建的Sunitinib药物涂层支架载药性能良好,有优良的血液相容性,在流体环境中反应良好。第三部分:Sunitinib药物涂层支架动物实验目的:在兔颈动脉模型中检测Sunitinib药物涂层支架的安全性和有效性。方法:将Sunitinib药物涂层支架(12枚)植入至兔颈动脉内。对照组为:将裸支架植入至兔颈动脉内(12枚)。术后在30、60、90d进行B型超声检查,观察支架的通畅率,记录颈动脉流速峰值(peak systolic velocity,PSV),处死前行颈动脉血管造影术,明确支架有无移位和通畅情况。处死后将兔颈动脉标本分为三段:第一段行苏木素-伊红染色,观察30、90d支架植入后内膜增生情况;第二段行扫描电镜检查;观察支架植入后内皮化情况;第三段行p-ERK的Western blot分析,探讨体内实验中,Sunitinib药物涂层支架抑制内膜增生的分子生物学机制。结果:24只新西兰大白兔在观察期间无死亡。B超提示24枚支架均通畅,造影提示支架在位,无移位、断裂。金属裸支架组PSV在观察期间可见轻微上升趋势,但无统计学意义,Sunitinib涂层支架PSV在观察期间未见上升趋势。90d后,内膜平均厚度:裸支架组:0.22±0.05mm,Sunitinib涂层支架组0.16±0.06 mm,P=0.03。金属裸支架和Sunitinib涂层支架内皮化程度未见明显差异:BMS:91.7±3.7%,SES:89.5±6.8%,P=0.24。Western blot 结果表明 Sunitinib 涂层支架可以通过抑制病理性平滑肌的p-ERK的表达,抑制内膜的增生。结论:在兔颈动脉模型中,Sunitinib药物涂层支架可抑制内膜增生,且不损害内皮化进程,这些作用是通过下调增生内膜p-ERK的表达得以实现。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543

【相似文献】