miR-199a-5p在慢性缺氧心肌内质网应激中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-22 02:12

  本文选题：mi　切入点：R-199a-5p　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景与研究目的:慢性低氧是紫绀型先天性心脏病(cyanotic congenital heart defect,CCHD)患者的主要病理生理特征之一,同时也见于一些慢性缺血缺氧性心脏病。在长期的低氧条件下,心肌组织可以对低氧环境产生适应,从而维持心肌细胞存活,确保心脏的功能,患者往往可以存活数年甚至更长时间,而不发生心力衰竭。探明心肌细胞对慢性低氧适应的机制,对于CCHD及缺血缺氧性心脏病的诊断、治疗尤其是CCHD患儿围手术期针对性的心肌保护具有重要的临床意义,但目前对此机制了解尚不完全。本科室既往研究发现CCHD患儿心肌细胞在慢性缺氧后引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),激活活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)信号途径的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),使内质网应激压力得以缓解,避免心肌细胞损伤和凋亡,起到保护心肌细胞的重要作用。另一方面,本课题组过去研究发现紫绀型先心病心肌组织在缺氧时激活炎症免疫反应导致STAT3信号活化,参与了对心肌细胞的保护作用。本课题在前期研究基础上,围绕miR-199a-5p,及其潜在的靶基因,ATF6和78-kD葡萄糖调节蛋白(78-kD glucose-regulated protein,GRP78)在心肌慢性缺氧时可能的调控作用开展了深入研究,同时,对缺氧时炎症免疫机制引起STAT3活化这一重要信号通路是否参与促进了miR-199a-5p的表达下调,也进行了研究探索。研究方法与内容:第一部分收集紫绀型先天性心脏病与非紫绀型先天性心脏病(Acyanotic congenital heart defects,ACHD)临床患者手术中切除的心肌组织,分析ATF6(p50与p90片段)、GRP78的蛋白与mRNA表达情况,检测心肌组织miR-199a-5p的水平,并进行其与心肌ATF6与GRP78表达水平,以及患者血氧饱和度之间的相关性分析。第二部分利用低氧培养的人心肌细胞株(Human Cardiac Myocyte,HCM)作为研究模型,进行常氧与低氧培养,通过microRNA模拟物miR-199a-5p mimic与抑制物mi R-199a-5p inhibitor转染干预细胞中mi R-199a-5p的水平后,检测ATF6、GRP78的蛋白与mRNA表达,应用流式细胞仪技术检测Annexin V阳性的细胞凋亡率并观察ERS凋亡相关蛋白chop的表达情况,应用双荧光素报告载体实验研究在hek293t细胞及常氧和低氧培养的hcm细胞中,mir-199a-5p对atf6和grp78的3'-utr区的靶向作用情况。第三部分检测cchd与achd患儿心肌组织中白介素(interleukin,il)-6和il-11的表达及stat3磷酸化情况。将balb/c小鼠在相当于正常大气50%氧含量条件下的低压低氧舱中暴露7天和21天,同时腹腔注射s3i-201干预stat3信号的激活,检测对mir-199a-5p水平及其前体原始microrna即pri-mir-199a-1和pri-mir-199a-2表达的影响。利用染色质免疫共沉淀(chip)技术,研究pstat3与pri-mir-199a启动子区的作用情况。此外,还观察了缺氧小鼠注射s3i-201干预stat3活化后,以及同时注射mir-199a-5pantagomir抑制mir-199a-5p的水平对心肌中mir-199a-5p靶基因atf6与grp78的表达及细胞凋亡的影响。研究结果:1.cchd患者心肌组织中mir-199a-5p与grp78、atf6的表达存在相关性利用手术中收集的心脏组织标本,发现cchd患者心肌组织中mir-199a-5p的水平显著低于achd患者,低氧后mir-199a-5p的降低与患者血氧饱和度的降低存在显著的正相关性。cchd患者心肌组织中atf6、grp78的mrna和蛋白表达水平相对achd较高。同时,cchd患儿心肌组织中mir-199a-5p的水平与atf6、grp78的表达水平存在显著的负相关性。2.低氧培养的心肌细胞中mir-199a-5p下调可促进grp78和atf6的表达通过建立人心肌细胞(hcm)的不同氧浓度(3%o2和1%o2)低氧培养模型,我们发现与常氧培养相比,中度低氧(3%o2)培养的hcm细胞atf6、grp78表达增加,upr增强,细胞未发生明显的凋亡反应,最接近cchd患儿慢性低氧后能生存及心肌细胞未严重受损的实际情况。而1%o2培养的hcm细胞虽然atf6、grp78表达也增加,但细胞出现了较严重的凋亡,因此在3%o2条件下培养hcm细胞被作为我们模拟cchd心肌细胞的体外研究模型。与常氧相比,持续的中度低氧(3%o2)可以导致心肌细胞mir-199a-5p水平数倍的降低。当将mir-199a-5pmimic转染至3%o2低氧培养的hcm中,则atf6和grp78的表达水平显著降低,内质网应激相关凋亡分子chop的表达和annexinv+细胞凋亡率显著增高,而mir-199a-5pinhibitor转染可导致缺氧hcm细胞atf6和grp78表达进一步增强和凋亡率进一步降低。上述结果提示心肌细胞低氧时mir-199a-5p的下调对atf6和grp78的表达具有显著的促进作用。我们通过构建含有atf6和grp78mrna3'-utr区mir-199a-5p潜在结合位点(野生型和突变型)序列的双荧光素报告载体,与mir-199a-5pmimic一起转染进hek293t细胞和hcm细胞,通过荧光素检测证明了mir-199a-5p对atf6和grp78的3'-utr区具有直接的靶向结合作用,且在hcm心肌细胞中这种靶向调控作用相比于hek293t细胞具有一定的组织细胞性优势。另外,通过双荧光素报告载体实验也证明,hcm细胞低氧培养时,由于内源性mir-199a-5p的水平降低,会导致mir-199a-5pmimic对atf6和grp78的3'-utr区的靶向作用减弱。3.低氧时心肌细胞stat3信号的活化促进了mir-199a-5p的水平下调与非紫绀组相比,紫绀型先心病组心肌组织中pstat3/stat3表达比值显著增高,显示stat3信号活化。同时,紫绀型先心病患儿心肌组织匀浆中il-6、il-11的表达水平显著高于非紫绀组,提示低氧通过诱导il-6、il-11等因子的生成激活心肌细胞stat3信号。相关性分析发现cchd患者心肌il-6、il-11的水平与mir-199a-5p的水平呈显著的负相关性。小鼠低氧暴露7天和21天时mir-199a-5p的水平相比常氧小鼠出现数倍的降低,qrt-pcr检测发现低氧导致mir-199a-5p的降低主要与其前体原始microrna分子pri-mir-199a-2(而非pri-mir-199a-1)的表达降低有关。若小鼠在接受低氧处理同时腹腔注射stat3特异性抑制剂s3i-201,则mir-199a-5p和pri-mir-199a-2的降低被显著阻碍。利用常氧与低氧下小鼠的心肌组织进行chip实验证实,pstat3可以与pri-mir-199a-2的启动子区进行结合,且低氧时这种结合性显著增强。小鼠低氧后导致心肌组织atf6和grp78的表达增高,但注射s3i-201干预stat3信号后,在mir-199a-5p的水平下降被抑制的同时,mir-199a-5p靶基因atf6和grp78的表达增高也被抑制,内质网应激相关凋亡蛋白chop的表达增高,提示细胞凋亡增多。另外,在干预stat3信号同时如果同时给予mir-199a-5pantagomir注射抑制mir-199a-5p的水平,则atf6和grp78的表达相对于单独干预stat3时增强,凋亡分子chop的表达可相对被抑制。结论综合本研究结果,cchd患者心肌细胞在长期低氧作用下,尤其是在低氧导致的心肌细胞炎症免疫机制激活引起stat3信号活化的情况下,mir-199a-5p的表达水平会显著降低,导致其靶基因atf6和grp78表达水平增高,促进未折叠蛋白反应增强,减缓缺氧引起的细胞内质网应激压力,对低氧环境下的心肌细胞起到保护作用,避免其损伤和凋亡,这有利于心肌组织对慢性低氧环境的适应。因此,mir-199a-5p有望成为对紫绀型先心病,以及其它慢性缺血缺氧性心脏疾病患者进行诊断、治疗、药物开发和CCHD围手术期心肌保护的有效靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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