循环miRNA-29a-3p水平与高血压左室肥厚的相关性研究

发布时间：2018-03-25 00:15

  本文选题：miRNA　切入点：心室肥厚　出处：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：高血压病不仅是一个重要的公共卫生问题,而且还是心血管疾病非常重要的危险因素,关系到近一半的心血管疾病的死亡率。它还是心力衰竭,包括舒张性和收缩性心衰的强大的风险因素。更为重要的是,规范化进行高血压的治疗可以有效预防其并发症的发生。我们称继发于高血压的复杂而多样的心脏结构和功能的改变为高血压性心脏病。主要表现为左心室肥厚、左心房增大,左心室收缩舒张功能降低,而这些病理改变也是心衰和房颤的风险因素。特别是左室肥厚,是高血压性心脏病的特征性改变。左室肥厚的发病机制是多因素的。对于异常的负荷条件,尤其是长期过高的后负荷作用,左室肥厚可以在一定限度下维持正常的室壁压力和力学性能。左室肥厚是高血压病明确的预后标志物,与高血压患者整体心血管病风险密切相关。除了左室质量,左室结构和几何形状的评估也对高血压心脏损害提供了更多的信息。50年前,Linzbach曾指出心室形态的特殊改变都是为了适应血流动力学变化的。左室肥厚主要表现为心肌细胞肥大和心肌细胞外基质重构。细胞外基质中胶原成分占85%,主要是I型和III型胶原。而胶原的合成和降解分别受胶原基因mRNA的转录和各种基质金属蛋白酶(matix metallo protein-ases,MMPs)的调节。有研究报道MMP-9在左室重构的过程中,其浓度与左室舒张末容积正相关,与左室射血分数负相关。提示MMP-9能够反映左室重构的程度。β肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)是由Myh7基因编码的一种慢反应ATP酶,该基因主要表达在胎儿时期,出生后被抑制。当心脏负荷增加时,β-MHC的表达将增加,同时会伴随心功能的降低。甚至在心脏疾病的发展过程中成为主要的表达形式。有研究表明,微小RNA-208a(microRNA-208a,miRNA-208a)之所以能够引起心肌肥厚,与mi RNA-208a导致的β-MHC过表达与心肌纤维化有关。另有研究显示,相较于健康人群,血浆心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)水平在高血压患者中显著增高,而且高血压伴心肌肥厚的患者血浆anp水平又显著高于不伴有心肌肥厚患者,因此血浆anp的含量可以作为判断左室肥大的参考指标。mirnas是一类非编码的,约包含22个核苷酸的小rna,在转录后水平调节基因的表达。通常通过与mrna的3’非编码区(3’un-translatedregions,3’-utr)以不完全的碱基互补结合方式,抑制翻译或降解mrna,其确切机制尚不清楚。mirna的一个关键的特征是一个mirna可以调控多个基因,一个基因也可以被多个mirnas调控。因此,mirnas提供了一个复杂的调控网络,控制着从基础的生理病理进程到广泛的心血管疾病,包括高血压病。心肌肥厚的发生发展伴随着大量mirnas的异常表达。近几年,已经有系列研究报道这些异常表达的mirnas。sayed、curcio等研究发现,mirna-1、mirna-133在心肌肥厚模型中表达下调。过表达mirna-133能够抑制由内皮素-1或苯肾上腺素刺激引起的蛋白合成和心肌细胞肥大,同时能够抑制心肌肥厚基因如anp、β-mhc的表达。mirna-29家族包括了mirna-29a、mirna-29b和mirna-29c,mirna-29家族在多种器官的纤维化过程发挥了重要的作用。研究显示转化生长因子因子β(tgfβ)/smad信号通路通过调节mirna-29家族,调节mmps的表达,促进肾脏纤维化。mirna-29a-3p参与了系统性硬化,mirna-29a-3p可以调节胶原的合成。抑制mirna-29可以促进胶原的合成和肾脏纤维化。血清mirna-29a-3p水平在肝纤维化患者中下降,过表达mirna-29b可以降低胶原的合成。过表达mirna-29b可以增加血管紧张素ii诱导的心肌纤维化,而血管紧张素ii诱导的心室纤维化与mirna-29a-3p和mirna-29c的表达水平下降有关。新近的研究显示mirna-29a-3p与肥厚性心肌病有关,血浆mirna-29a-3p水平与肥厚性心肌病患者超声心动图和心脏磁共振所测的心脏肥厚和纤维化指标相关,提示了mirna-29a-3p可能与心室肥厚和纤维化有关。本研究旨在通过iontorrent半导体高通量测序技术和sybrgreeni实时荧光聚合酶链反应(polymerasechainreaction,pcr)技术,检测高血压左室肥厚患者、单纯高血压患者和健康对照者血浆mirnas的表达谱,筛选高血压左室肥厚患者血浆中差异表达的mirnas分子,比较并证实候选mirna-29a-3p分子属于差异表达显著的mirnas分子之一,同时对mirna-29a-3p进行靶基因预测和基因功能分析。进而对mirna-29a-3p与mmp-9、i型和iii型胶原进行相关性研究,揭示mirna-29a-3p与高血压左室肥厚心肌纤维化的关系。最后通过动物实验,运用westernblot方法,揭示抑制mirna-29a-3p表达能够抑制anp和β-mhc蛋白水平的升高,改善心肌肥厚的程度。本研究技术路线:收集高血压左室肥厚患者、单纯高血压患者和健康对照者三组人群的血浆样本。构建3个血浆样本库,进行高通量测序,获得三组人群的mirnas表达谱,筛选出高血压左室肥厚患者差异表达的mirnas分子。比较并证实候选mirna-29a-3p分子属于我们筛选出来的差异表达显著的mirna分子之一,然后对mirna-29a-3p进行基因功能分析,包括靶基因预测,基因功能分析(geneontologyanalysis,go-analysis)和信号通路分析(pathwayanalysis)。其次,运用sybrgreeni实时荧光pcr技术,在上述三组大规模人群验证并测取mirna-29a-3p相对表达量,与心肌纤维化指标mmp-9、i型和iii型胶原做相关性分析。最后通过小鼠主动脉弓缩窄(transverseaorticconstriction,tac)术,获得压力负荷所致左室肥厚的动物模型,运用免疫印迹(westernblot)方法,揭示抑制mirna-29a-3p的表达可以抑制心室肥厚指标anp和β-mhc蛋白水平的升高,为高血压左室肥厚和重塑的治疗提供新的分子靶点。第一部分高血压左室肥厚患者循环mirnas表达谱分析及mirna-29a-3p基因功能分析目的:筛选高血压左室肥厚患者血浆中差异表达的mirna分子并对mirna-29a-3p进行基因功能分析方法:1选取高血压左室肥厚患者、单纯高血压患者及健康对照三组人群各20名,制备成3个血浆库样本。应用iontorrent半导体高通量测序技术,检测三组研究对象的mirnas表达谱,并筛选差异表达的mirnas分子。对候选mirna-29a-3p进行靶基因预测、go分析和pathway分析。2实验数据应用spss13.0(spss公司,加工,芝加哥,美国)统计软件进行统计分析。主要统计指标均进行正态性检验,计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用snk检验;计数资料以例(%)表示,组间对比行χ2检验,率的两两比较采用scheffe法。检验水平α=0.05,以p0.05表示组间差异具有统计学意义。3运用fast-qc软件对测序数据的质量进行整体评估;采用差异表达基因的rna-seq的数据(identifydifferentiallyexpressedgenesfromrna-seqdata,degseq)算法对mirnas?标准化后的基因表达量(transcriptspermillionreads,tpm)值进行差异筛选,其中倍性变化(foldchange)1.5或0.667,p值0.05,误判率(fdr)0.05为显著性差异mirnas。以国际公认的mirna靶基因预测数据库mirnabase与targetscan结合,预测出mirna-29a-3p调控的所有靶基因。首先基于数据库将靶基因进行go注释,得到基因所参与的所有go,同时采用fisher检验计算得到每个go的显著性水平(p-value),然后校正多重假设检验的结果并获得fdr,最终筛选出靶基因富集的显著性go。其次基于kegg数据库,对靶基因进行pathway注释,获得基因参与的所有pathway,使用基于超几何分布(hypergeometricdistribution)的fisher检验计算每个pathway的显著性水平(p-value),校正多重假设检验的结果并获得fdr,从而筛选出靶基因所体现的显著性pathway。结果:1研究对象一般情况:高血压左室肥厚组病例的平均年龄在63.50±6.03岁,其中男性13人(65.0%),女性7人(35.0%);高血压组病例的平均年龄在64.50±8.10岁,其中男性12人(60.0%),女性8人(40.0%);健康对照组对象平均年龄在65.80±7.68岁,其中男性13人(65.0%),女性7人(35.0%),三组人群在年龄、性别、吸烟状态、空腹血糖情况及体重指数(bmi)分布无显著性差异(p0.05);在血压,包括收缩压(sbp)和舒张压(dbp)和高血压病程方面,同对照组比较,高血压组与高血压合并左室肥厚组具有显著性差异,有统计学意义(p0.05),但两组间比较差异不显著无统计学意义(p0.05);在lvmi方面,三组间两两比较,差异显著(p0.01),有统计学意义。上述资料表明研究结果具有可对比性;2三组研究对象的iontorrent半导体高通量测序结果:为表述方便,下文及图表中以s1为健康对照样本,s2为高血压疾病对照样本,s3为高血压左室肥厚疾病样本。2.1差异表达分析:按照方案设计,将s2vss1,s3vss1,s3vss2进行差异mirnas筛选。采用degseq算法对313个mirna的tpm值进行差异筛选,其中foldchange1.5或0.667,p-value0.05,fdr0.05为显著性差异mirna。s2vss1共有59个差异表达的mirnas,其中表达上调的28个,表达下调的31个;s3vss1共有87个差异表达的mirnas,其中表达上调的66个,表达下调的21个;s3vss2共有75个差异表的mirnas,其中表达上调的55个,表达下调的20个;2.2mirna-29a-3p差异表达谱的结果:mirna-29a-3p在s2vss1中,表达有差异,但不显著,foldchange为1.253332;在s3vss1中,差异显著,foldchange为2.6910523;在s3vss2中,差异显著,foldchange为2.147118894。表明mirna-29a-3p水平与高血压所致的左室肥厚存在相关性;3mirna-29a-3p靶基因分析:3.1mirna-29a-3p靶基因预测结果:将mirna-29a-3p与国际公认mirna靶基因预测数据库mirnabase与targetscan结合,我们共得到884个靶基因,score为mirna-29a-3p与其靶基因的结合分值,分值越高,靶基因预测的准确性越高;3.2靶基因功能分析结果,我们将上述得到的靶基因基于数据库进行go注释,通过基因功能分析,得到显著影响的go及其包含的基因。并且从三个层面进行分析,分别为:生化进程(biologicalprocess,bp);分子功能(molecularfunction,mf);细胞组成(cellularcomponent,cc)。其中go显著性最高的前5个为细胞外基质(extracellularmatrixorganization,ecm)、胶原分解代谢进程(collagencatabolicprocess)、细胞外基质分解(extracellularmatrixdisassembly)、细胞质膜黏附分子介导的同源细胞黏附(homophiliccelladhesionviaplasmamembraneadhesionmolecules)、胶原纤维合成(collagenfibrilorganization),其-log2p值分别为:19.42798892、18.94812724、17.45448077、16.10443753、13.84480546;3.3信号通路分析结果:pathway-analysis是基于基因注释数据库,检测差异基因显著pathway的手段。我们以mirna-29a-3p的靶基因为研究对象,通过基因信号通路分析,得到显著影响的pathway及其包含的基因。其中显著性pathway前5个为蛋白质分解吸收(proteindigestionandabsorption)、细胞外基质受体相互作用(ecm-receptorinteraction)、pi3k-akt信号通路(pi3k-aktsignalingpathway)、黏着斑(focaladhesion)、小细胞肺癌(smallcelllungcancer),其-log2p值分别为:23.17177941、21.10576753、20.66932209、20.28737691、15.27204612。第二部分mirna-29a-3p水平与高血压左室肥厚患者心肌纤维化的相关性分析目的:探讨高血压伴左室肥厚患者mirna-29a-3p的水平与心肌纤维化程度的相关性。方法:1选取高血压合并左室肥厚患者,单纯高血压患者以及健康对照者三组为人群为研究对象,应用sybrgreeni实时荧光pcr技术检测血浆中mirna-29a-3p水平;双抗体酶联免疫吸附(elisa)法测定血清基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、i和iii型胶原标志物:i型胶原氨基端肽(propeptideoftypeiprocollagen,pinp)和iii型胶原氨基端肽(propeptideoftypeiiiprocollagen,piiinp)水平。2实验数据应用spss13.0软件包(spss公司,加工,芝加哥,美国)进行统计分析。主要统计指标均进行正态性检验,计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用snk检验;计数资料以例(%)表示,组间对比行χ2检验,率的两两比较采用scheffe法。检验水平α=0.05,以p0.05表示组间差异具有统计学意义。相关分析采用person法。差异显著性水平定义为p0.05。结果:1研究人群基本特征:本部分实验共入选高血压左室肥厚患者70名,其中男性39名(55.7%)女性31名(44.3%);入选高血压患者80名,男性42名(52.5%)女性38名(47.5%);健康对照者50名,其中男性28名(56.0%)女性22名(44.0%)。三组间平均年龄分别为:61.50±8.03岁;63.20±8.20岁和62.01±7.80岁。基本特征:性别、年龄、吸烟、空腹血糖、bmi等指标在三组间比较未见显著性差异(p0.05);但在血压,包括sbp和dbp和高血压病程方面,同对照组比较,高血压组与高血压合并左室肥厚组均差异显著有统计学意义(p0.05),但高血压组与高血压合并左室肥厚组两组间比较差异不显著无统计学意义(p0.05);在lvmi方面,三组间两两比较,差异显著(p0.01),有统计学意义;2三组研究对象血清mirna-29a-3p相对表达量如下:对照组1.72±0.79;高血压组3.52±1.21;高血压合并左室肥厚组5.37±1.56。与健康对照组比较,高血压和高血压合并左室肥厚组患者血清mirna-29a-3p水平均明显升高,而高血压合并左室肥厚组患者血清mirna-29a-3p水平高于单纯高血压组患者,统计学有意义,p0.05。3三组研究对象血清心肌纤维化指标检测结果显示比较对照组,高血压和高血压合并心室肥厚的患者血清pinp、piiinp和mmp-9水平均明显升高,统计学有意义,p0.05;高血压合并心室肥厚患者血清pinp、piiinp和mmp-9水平高于单纯高血压患者,统计学有意义,p0.05;4血清mirna-29a-3p与心肌纤维化项指标mmp-9、pinp和piiinp的相关性分析,结果显示了mirna-29a-3p表达水平与血清pinp、piiinp和mmp-9水平呈正相关,相关系数分别为0.58、0.45和0.66,统计学有意义,p0.05。第三部分抑制mirna-29a-3p改善小鼠压力负荷所致的左室肥厚与心肌纤维化目的:抑制mirna-29a-3p改善压力负荷所致的左室肥厚与心肌纤维化方法:1纳入11-12周龄c57bl/6雄性小鼠,体重约25g,共60只,随机分为2组:假手术组20只和主动脉弓缩窄(tac)手术组40只,tac组小鼠在术后7d随机给予antagomirna阴性对照或antago-mirna-29a-3p腹腔注射3次,分为tac+antagomirna阴性对照组20只,tac+antagomirna-29a-3p组20只,术后4周he染色检测心肌细胞横截面面积;masson染色检测心肌纤维化面积;westernblot检测anp和β-mhc蛋白表达水平。2实验数据应用spss13.0软件包(spss公司,加工,芝加哥,美国)进行统计分析。主要统计指标均进行正态性检验,计量资料用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用snk检验;差异显著性水平定义为p0.05。结果:1三组小鼠超声检测结果:三组小鼠在建模前测得的左室舒张末内径(leftventricularinternaldiastolicdiameter,lvids)、左室收缩末内径(leftventricularinternalsystolicdiameter,lvids)、左室舒张末期后壁厚度(leftventricularposteriorwalldiameter,lvpwd)和计算出的左室短轴缩短率(leftventricularfractionalshortening,lvfs)无显著性差别,无统计学意义,p0.05。建模后4周得到的上述四项指标与建模前指标进行组内比较,除假手术组外,tac+antogomirna阴性对照组和tac+antagomirna-29a-3p组均有显著性差异,有统计学意义,p0.01。建模4周后,与假手术组比较,tac+antogomirna阴性对照组和tac+antagomirna-29a-3p组在lvidd、lvids、lvpwd和lvfs指标上均有显著性差异,有统计学意义,p0.01;tac+antogomirna阴性对照组与tac+antagomirna-29a-3p组比较,上述四项指标有显著性差异,有统计学意义,p0.01;2小鼠左室心肌组织病理学检测:2.1经he染色,心肌细胞横截面积进行测量分析结果显示:与假手术组比较,tac+antogomirna阴性对照小鼠及tac+antogomirna-29a-3p小鼠左心室心肌细胞呈现肥大表现,心肌间质也有不同程度的增多。其中tac+antogomirna阴性对照小鼠表现最为明显,tac+antogo-mirna-29a-3p小鼠心肌细胞肥大程度及间质增生程度表现介于假手术组和tac+antogomirna阴性对照之间。三组间比较差异显著,p0.05;2.2masson染色结果显示,假手术组小鼠的心肌细胞呈现紫红色或者红色,形态规整,其间排列少量呈现蓝色的胶原纤维。tac+antogomirna阴性对照小鼠及tac+antogomirna-29a-3p小鼠左心室心肌纤维排列紊乱,而且有部分断裂,蓝色胶原纤维增多明显,其中tac+antogomirna-29a-3p组纤维增生程度少于tac+antogomirna阴性对照组。三组间比较差异显著,有统计学意义,p0.05。心肌纤维化面积结果见;3免疫印迹结果显示:对比假手术组,tac小鼠心肌组织反映心肌肥大的anp和β-mhc蛋白表达水平明显升高,而antagomirna-29a-3p可以抑制anp和β-mhc蛋白水平的升高,有统计学意义,p0.05,提示antagomirna-29a-3p可以抑制tac诱导的心肌细胞肥大。结论:1通过iontorrent半导体高通量测序技术,获得健康对照组、高血压组及高血压左室肥厚组的血浆循环mirnas表达谱。2将对照组、高血压组及高血压左室肥厚组的循环mirnas两两比对采用degseq算法对tpm值进行差异筛选,获得显著差异表达的mirnas。3对mirna-29a-3p进行靶基因预测,并对其靶基因进行go分析获得显著影响的基因功能及其包含的主要基因;通过对mirna-29a-3p的keggpathway分析,获得mirna-29a-3p可能参与的主要信号通路及相关靶基因。4高血压左室肥厚患者mirna-29a-3p水平及血清pinp、piiinp和mmp-9水平明显高于健康对照组,亦高于单纯高血压组。5高血压左室肥厚的患者mirna-29a-3p表达水平与血清pinp、piiinp和mmp-9水平呈正相关,血清mirna-29a-3p有可能成为心室肥厚和纤维化的生物学标记物,评估疗效和预后。6antagomirna-29a-3p能够在一定程度上改善压力负荷所致的心室腔增大和心功能的恶化。7antagomirna-29a-3p可以抑制tac诱导的心肌细胞肥大和心肌纤维化,可以抑制心室肥厚指标anp和β-mhc蛋白水平的升高。8mirna-29a-3p有可能成为高血压心室肥厚和重塑的治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R544.1
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本文编号：1660683