人参皂甙Rb1调节巨噬细胞极化稳定动脉粥样硬化斑块及其机制研究

发布时间：2018-03-28 14:35

本文选题：人参皂甙Rb1　切入点：M2巨噬细胞　出处：《青岛大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景:动脉粥样硬化(AS)是一种发生在动脉管壁的慢性炎症性疾病。炎症反应增加了斑块的面积及其复杂性。平滑肌细胞、巨噬细胞及内皮细胞参与斑块的炎症反应,其中巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。巨噬细胞是一种可塑性很强的细胞,在不同的微环境的刺激下,巨噬细胞可以分成两种表型:干扰素-?(IFN-?)或者脂多糖(LPS)诱导的细胞命名为M1;IL-13或者IL-4诱导的细胞命名为M2。这两种巨噬细胞分别通过分泌促炎和抗炎细胞因子在炎症反应中发挥不同作用。M1是有效的防御细胞,能够杀死微生物,产生促炎细胞因子,比如TNF-α、IL-6和IL-1β。相反,M2产生抗炎细胞因子,缓解炎症反应,促进了血管再生和组织修复,如IL-10,TGF-β。最近的研究证明M2巨噬细胞在动脉粥样硬化中可能发挥保护作用。在Apo E-/-小鼠早期斑块中有更多M2巨噬细胞,然而在晚期斑块中有更多M1巨噬细胞。最近的研究已经证明巨噬细胞表型决定斑块的结局。人参皂甙Rb1是人参的活性成分,人参是一种在东亚地区被广泛应用的草本植物。许多研究已经证实了它强大的药理学作用,包括抗癌、抗炎、降脂、抗肥胖及抗缺血再灌注损伤和内皮细胞凋亡。Rb1也已经被证实有强大的抗炎效应及降低高脂喂养肥胖小鼠的促炎细胞因子水平。考虑到巨噬细胞在炎症反应中的作用,我们假设Rb1可能通过影响巨噬细胞极化增加动脉粥样硬化斑块的稳定性及降低炎症反应。目的:1.观察Rb1对动脉粥样硬化斑块稳定性的作用。2.探讨Rb1是否通过影响巨噬细胞极化进而改善动脉粥样硬化斑块稳定性及其可能机制。方法:1.分离腹腔巨噬细胞C57BL/6小鼠(8-10周龄)腹腔注射1 m L 3%巯基乙酸肉汤。3天后,用冷的PBS冲洗小鼠腹腔收集巨噬细胞。800 rpm离心5分钟后,去掉PBS,用1640 RPMI培养基(含10%FBS和1%双抗)重悬细胞。种板,3 h后用PBS冲洗去除非贴壁细胞。2.细胞培养RAW264.7细胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养,放于37°C含有5%CO2的孵箱中。RAW264.7细胞系被分为六组:control,LPS,LPS+Rb1(10μM,20μM,40μM,80μM)。3.蛋白质印迹法检测i NOS,Arg1,p-stat6和stat6蛋白表达水平。4.流式细胞术RAW264.7被清洗、封闭,用APC结合的抗鼠的CD206抗体孵育。流式细胞仪(BD Biosciences)收集细胞,结果用Flow Jo(Tree Star,Inc.)分析。5.细胞因子的检测细胞上清的MMP-9、IL-10、IL-4和IL-13水平用酶联免疫吸附法(ELISA)测定。6.主动脉染色用油红O染色观察脂质含量,用天狼猩红染色观察胶原含量,用MOMA-2抗体染斑块巨噬细胞,用α-SMA抗体染斑块平滑肌。为评估斑块平滑肌稳定性,我们用斑块稳定性指数:(胶原含量+平滑肌含量)/(油红O染色面积+巨噬细胞含量)。结果1.与LPS组相比,Rb1剂量依赖性的抑制i NOS(M1标记物)的表达,同时20和40μM Rb1增加Arg-1(M2标记物)的表达。另外,通过流式细胞学分析Rb1组CD206+细胞数目百分比明显高于LPS组。Rb1抑制促炎细胞因子MMP-9的分泌,促进抗炎细胞因子IL-10的分泌。2.Rb1处理细胞24 h后,细胞上清的IL-4和IL-13水平明显升高。IL-4和IL-13的中和抗体能够部分减弱Rb1对M2的极化效应。3.用20μM Rb1处理细胞后,p-STAT6较LPS组有明显增加。STAT6的抑制剂(leflunomide)能够明显抑制Rb1诱导的M2极化效应。4.Rb1处理小鼠7周后,斑块脂质和巨噬细胞的含量明显降低,胶原和平滑肌的含量明显增加。同时计算Rb1组斑块稳定性增加,斑块内MMP-9表达减少。5.Rb1组斑块MOMA-2+i NOS+双阳性细胞数目降低,MOMA-2+Arg-1+双阳性细胞数目增加。结论:1.Rb1通过促进IL-4/IL-13的分泌诱导M2巨噬细胞极化。2.STAT6在Rb1诱导M2巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。3.Rb1通过诱导M2巨噬细胞极化增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

【参考文献】