病毒及人源miRNAs调节巨核细胞增殖与发育的研究

发布时间：2018-03-30 08:22

  本文选题：微小RNA　切入点：EB病毒　出处：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：第一部分：病毒miRNA调控巨核细胞发育的研究目的：研究病毒ebv-miR-BART6-3p对巨核细胞增殖及分化发育的影响,并探讨其可能的机制。方法：(?)收集20例脐血单个核细胞分离CD34+造血祖细胞扩增为巨核细胞。(?)构建ebv-miR-BART6的表达载体,转染入CD34+造血祖细胞定向培养巨核细胞。(?)应用流式细胞仪、免疫组织化学染色分析各组CD41阳性率差异,鉴定巨核细胞。(?)应用倒置显微镜下观察巨核细胞集簇形态,吉姆萨染色光镜分析巨核细胞形态学变化,透射电镜分析巨核细胞超微结构差异。(?)应用甲基纤维素混合MegaCult-C培养巨核细胞集落,检测各组巨核细胞分化能力。(?) QRT-PCR法分析各组miR-185表达差异。(?) Target scan预测分析miR-185下游靶标为ABCG4,荧光素酶实验证实miR-185下游靶标为BCG4.(?) QRT-PCR和WB分析ebv-miR-BART6对ABCG4基因mRNA和蛋白表达的影响。结果：(?)构建病毒ebv-miR-BART6-3p载体,将病毒miRs载体及空白载体(阴性对照)均转染入脐血单个核细胞分离CD34+造血祖细胞定向扩增为巨核细胞,以未处理组为空白对照。流式细胞仪检测转染率超过75%。流式细胞仪分析三组巨核细胞CD41表达率发现,ebv-miR-BART6-3p转染组CD41阳性细胞率为21.4±5.71%,而空白对照组为36.2±4.09%,阴性对照组为32.7±6.83%。免疫组织化学法分析三组巨核细胞CD41表达率为ebv-miR-BART6-3p转染组CD41阳性细胞率为17.3±8.33%,而空白对照组为33.7±±6.27%,阴性对照组为30.3±5.83%。吉姆萨分析巨核细胞形态学发现,空白对照和阴性对照组巨核细胞胞体巨大,胞核不规则,发育成熟。而ebv-miR-BART6-3p组小巨核细胞为主。透射电镜结果显示两对照组板障结构明显多于ebv-miR-BART6-3p组。内质网丰富。巨核细胞集簇实验显示,ebv-miR-BART6-3p组每个集簇细胞数为4.6±2.2 cells/colony而空白对照组为16.3±3.7 cells/colony阴性对照组为14.7±4.3 cells/colony,接种1000个细胞在6孔板内,空白对照组生产克隆数为483±51,阴性对照组为407±47而ebv-miR-BART6-3p组为217±33。(?) QRT-PCR分析显示ebv-miR-BART6-3p下调巨核细胞]miR-185-5p的表达0.323±0.034 vs 0.953±0.097(阴性对照),空白对照组标准化为1。(?) miR-185-5p种子序列有2个结合ABCG4基因3`UTR区的位点,荧光素酶实验分析结果显示双靶标野生型ABCG4荧光素酶活性下降为0.317±0.127,单独突变位点1后荧光活性为0.63±0.105,单独突变位点2一个活性为0.767±0.151,双位点突变后荧光活性为0.91±0.096。(?) QRT-PCR分析ebv-miR-BART6-3p转染后ABCG4表达上调为3.327±0.687 vs1.033±0.126(阴性对照),空白对照组标准化为1。WB分析显示ABCG4蛋白表达也显著高于对照组。结论：(?) ebv-miR-BART6-3p抑制巨核细胞增殖、分化。(?) ebv-miR-BART6-3p下调巨核细胞miR-185-5p表达,进而使后者靶标ABCG4表达升高。第二部分：hsa-miR-146参与巨核细胞增殖及其与ITP预后相关性的研究目的： 证实hsa-miR-146参与巨核细胞增殖并与ITP预后密切相关方法：(?)收集10例脐血单个核细胞分离CD34+造血祖细胞扩增为巨核细胞,根据参考文献选定浓度为10uM达沙替尼处理。(?)应用流式细胞仪分析各组CD41阳性率差异,鉴定巨核细胞。(?)应用吉姆萨染色光镜分析巨核细胞形态学变化,透射电镜分析巨核细胞超微结构差异。(?)应用miRNA芯片分析达沙替尼处理前后巨核细胞miRs的表达变化。对比前期ITP患者血浆及AB正常血浆孵育巨核细胞niRs表达谱,通过聚类分析发现8种hsa-miRs差异在2.5倍以上。(?)收集10例ITP患者血浆,QRT-PCR法验证芯片结果,发现miR-146最为稳定,扩大ITP患者例数为56例,分析其动态变化与预后相关性。结果：(?)达沙替尼促进巨核细胞增殖及分化,但抑制血小板生成。流式细胞仪检测达沙替尼组CD41表达率为40.8±3.22%,对照组为32.6±4.71%。免疫组织化学法分析两组巨核细胞CD41表达率,对照组CD41阳性细胞率为31.28±5.67%,达沙替尼组为38.92±6.23%。吉姆萨分析巨核细胞形态学发现,对照组巨核细胞胞体巨大,胞核不规则,发育成熟,细胞周围有比较成熟的血小板成簇分布。达沙替尼组巨核细胞体积接近正常对照组,胞核也不规则,胞浆较为丰富,胞浆内仅有少许不成熟巨大血小板颗粒。透射电镜结果显示对照组板障结构明显多于达沙替尼组。巨核细胞集簇实验显示,接种1000个细胞在6孔板内,对照组生产克隆数为447±69,达沙替尼组为527±39。(?)达沙替尼用药与否的巨核细胞miRs芯片与ITP患者血浆或正常AB血浆孵育巨核细胞miRs芯片聚类分析发现8个hsa-miRs表达差异均在2.5倍以上。(?)收集ITP患者血浆,QRT-PCR验证芯片结果,miR-146与ITP疾病进展密切相关。结论：(?)达沙替尼促进巨核细胞增殖、抑制产板,上调miR-146表达。(?)miR-146与ITP预后密切相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R558.2

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本文编号：1685095