动脉粥样硬化血清生物标记物的蛋白组学分析及CDK9疾病相关性研究

发布时间：2018-04-01 19:25

本文选题：动脉粥样硬化　切入点：炎症　出处：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景及目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管疾病的主要病理学变化,也是心血管疾病致死的主要原因。临床血清学诊断动脉粥样硬化的传统指标包括检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(Highh density protein, HDL)和低密度脂蛋白(Low density protein, LDL)等。然而动脉粥样硬化是一种涉及多种病因、多种生理病理变化的慢性复杂性疾病,除上述检测指标提示的脂质浸润状况外,还包括其它病理生理致病因素,如血管内皮功能异常、炎症反应、氧化应激、细胞增殖/凋亡以及血小板激活-凝血反应等。近年研究发现,某些疾病标记物如C-反应蛋白(CRP,C-reactive protein)可出现在动脉粥样硬化疾病的全过程,而某些标记物只在疾病特定阶段表达产生,如细胞间黏附分子-1(ICAM-1, Intracellular adhesion molecule-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1, Monocyte-chemokine protein-1)、血清淀粉样蛋白A(SAA, Serum amyloid A)、金属基质蛋白酶(MMPs, Matrix Metalloproteinases)、髓过氧化物酶(MPOMyeloperoxtidase)以及与血栓形成相关的纤维蛋白原和可溶性CD40L等,其中CRP是目前研究最多的动脉粥样硬化生物标记物。CRP主要是在感染、损伤等条件下,由白细胞介素-6(IL-6, Interleukin-6)诱导肝细胞合成。在Ca2+存在下,CRP与受损细胞结合,激活补体系统,促进动脉粥样硬化的形成。研究报道：MCP-1在动脉粥样硬化动物模型斑块中大量表达；抑制MCP-1活性可明显减少斑块的形成。妊娠相关血浆蛋白A(PAPPA,Pregnancy associated plasma protein A),是一种由合胞体滋养层合成的糖蛋白,一般用于妊娠期间Down氏综合征筛查。PAPPA可导致粥样硬化完整保护帽破裂,其浓度升高与动脉粥样硬化密切相关。此外,近期研究发现软骨糖蛋白YKL-40浓度升高也与动脉粥样硬化相关。既往有关动脉粥样硬化生物标记物研究的共同特点是：各自仅针对特定的分子,具有一定局限性。动脉粥样硬化是一个多因素参与的病理过程,只有针对整个系统而不仅仅是单个分子才有可能发现更全面、更准确、更易重复和标准化的生物标记物。因此,在整体水平上探索生物系统组成及其活动规律的组学研究‘'omics"显示重要价值,可为阐明心血管疾病发生发展机制提供新的线索,同时可以为早期诊断、危险分型和预后评估提供新的依据,具有重要理论意义和临床应用前景。但目前有关疾病蛋白组学的研究报道仍然较少,尤其是关于动脉粥样硬化的血清蛋白组学尚未见研究报道。在不同层次的组学研究中选择血清蛋白质组具有独特优势：一是血清样本获取便捷,便于临床应用；二是血清蛋白信息量大：疾病状态下机体多种组织和细胞分泌的疾病相关蛋白可以进入血液循环,组织细胞表面蛋白也可“脱落”到周围环境而进入血液循环,循环内的各类细胞如单核细胞、淋巴细胞、血小板等都可以分泌或“脱落”多种蛋白；三是血中含有1×106种蛋白质,含量差别可达到1010,高度优化的去除高丰度蛋白的血清蛋白组学研究可在一定程度减少研究的复杂性。本项目利用临床确诊的动脉粥样硬化患者血清标本,将基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI/TOF/MS, Matrix-assisted laser desorption ionization/Time of Flight/Mass Spectrum)检测蛋白组学方法进行改进,对动脉粥样硬化血清生物标记物进行筛选鉴定,为确立临床可应用的动脉粥样硬化血清生物标记物,阐明动脉粥样硬化发生发展机理提供依据。近年研究表明,细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9, Cyclin-dependent kinase 9)在调节细胞周期和监测促炎反应基因的激活中起到关键作用。越来越多的CDK9抑制剂或药物,如PHA767491、FLA (Flavopiridol)获得快速研究开发。尽管如此,在关于动脉粥样硬化的炎症机制和冠状动脉粥样硬化病变的研究中,涉及CDK9的报道仍然很少。本论文第一部分蛋白组学研究结果表明：在冠脉动脉粥样硬化患者和健康对照血清中,多种蛋白分子表达存在差异；其中CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清中表达显著增多。结合表达差异程度和新近文献报道,我们选择CDK9作为冠状动脉粥样硬化血清标记物进一步研究的候选分子进行重点研究。在论文第二部分,扩大样本,进一步验证了CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、外周血单个核细胞、单核细胞及在动脉斑块组织中的异常高表达水平。第三部分选择人单核细胞急性白血病细胞系THP-1,利用CDK9抑制剂FLA,初步研究了FLA对炎症刺激状态下的人单核细胞CDK9同种型表达、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和凋亡相关蛋白表达的影响,并以上述结果为依据探讨了CDK9参与动脉粥样硬化炎症的可能机制以及CDK9作为冠状动脉粥样硬化生物标记物的可能性,以期为靶向CDK9诊断和治疗冠状动脉粥样硬化提供实验及理论依据。第一部分利用蛋白组学方法研究冠状动脉粥样硬化血清蛋白标记物研究目的优化血清蛋白组学技术方法,探讨动脉粥样硬化发病过程中血清蛋白的异常表达情况。研究方法1、研究对象随机选取2012年10月至2014年10月山东省立医院及山东大学齐鲁医院确诊冠心病患者43例,其中男25例,女18例,年龄60±3.3岁。入选病例均符合WHO制定的冠心病诊断标准。选择同期健康查体者38例作为健康对照,其中男17例,女21例,年龄58±11.1岁。无动脉粥样硬化、冠脉血管疾病或炎症性疾病；经常规检测胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和血糖水平,排除高脂血症、高血压、糖尿病。经病史询问、体检、心电图检查和其它生化检查无异常发现。本研究由山东大学医学院伦理委员会批准,患者均知情同意。2、血清收集和血清蛋白的提取处理抽取冠状动脉粥样硬化患者或健康对照空腹静脉血5毫升,分离血清。经Albumin and IgG Removal Kit操作处理,去除白蛋白和IgG等血清高丰度蛋白。经ReadyPrepTM 2-D Clean-up Kit(二维清除试剂盒)操作处理,清除血清样本中的盐类、脂类、核酸等干扰物质。随后收集上清液,将约300μg的蛋白质重悬在尿素水化液中。3、蛋白等电聚焦(IEF)将IPG干胶条(pH3-10, NL:18cm, ImmobilineTM DryStrip)条槽置于水平板上,加入样本尿素水化液,然后滴加Dry Strip覆盖液覆盖,加盖封闭。沿电极平行方向将凝胶条槽置于IPGphor电极板上,按照要求设置血清样本电压程序。蛋白等电聚焦测量仪器为Ettan IPGphorTM。4、蛋白二维电泳(2-DE)蛋白等电聚焦后,经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将IPG胶条中的蛋白进行分离。在实验中使用的电泳参数是：5W/胶,40分钟；然后调整为15W/胶,直至完成。然后,对SDS-PAGE胶进行银染色,利用凝胶图像分析系统进行凝胶成像,通过2D-PDQuest图像分析软件对图像中的蛋白质点进行定量分析,对感兴趣的蛋白质点进行定位。5、胶内酶解用硅烷化处理过的加样枪头,从蛋白二维电泳胶上分别切取丰度不同的蛋白点,采用改进的胶内酶解流程酶解处理,最后收集得到蛋白样本。6、质谱分析(MS)将胶内酶解得到的蛋白样本尿素水化溶解液1.5μL,点滴于样品靶板上,室温干燥后,取1μL基质覆盖于样品上。待基质完全结晶后,把样品靶板放入质谱仪检测。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)进行酶解产物鉴定。采集数据的条件和模式：反射模式、正离子谱测定,自动获取数据。首先用质谱标准试剂盒(Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Analyzer)的酶解肽段外标校正仪器,离子延迟提取100m,质谱信号累加500次的单次扫描,激光频率为20.0赫兹(Hz),基质和样品的多肽质谱指纹谱质量扫描范围是100-3000u。7.数据分析及处理利用Mascot软件,对所得质谱数据,通过NCBI Human蛋白数据库检索可与之相匹配的蛋白；根据检索结果广泛查阅文献,结合文献报道和蛋白质凝胶上的等电点和分子量,鉴定所检测到的蛋白质种类。研究结果1、成功优化了血清蛋白组学研究策略：1.1去除血清样本中的高丰度蛋白和去盐去杂质鉴于血清白蛋白和免疫球蛋白约占血清总蛋白的90%,而疾病血清蛋白标记物通常为低丰度蛋白,高丰度蛋白可严重干扰低丰度蛋白的探测,因此本论文利用Albumin and IgG Removal Kit (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA),成功去除了血清样本中白蛋白和免疫球蛋白IgG两种高丰度蛋白,从而为探测疾病相关低丰度蛋白建立了基础。由于样本中的盐类、脂类、核酸及杂质等严重干扰蛋白质组学分析,本论文利用ReadyPrepTM 2-D Clean-up Kit,对血清样本进行处理,有效清除了盐类、脂类、核酸及杂质等干扰物质,增加了检测灵敏度。1.2多步骤优化血清蛋白组学操作方法在研究过程中,针对血清样本在去除高丰度蛋白后,二维电泳凝胶图仍存在蛋白点数少,出现横纹、垂直条纹等问题,本文在上样的蛋白量、SDS-PAGE的pH值、SDS浓度条件、IEF电泳条件及程序等方面进行了系列探索,经2D-clean-up kit去除盐类、脂质、核酸等干扰物质,改进IEF电压程序和SDS-PAGE条件,最终获得比较理想的二维电泳图,蛋白点分离较好。本论文在多个步骤上改进优化了血清样本等电聚焦的电压程序,改善改进了胶内酶解的方法及过程,建立了比较简便快速的血清蛋白组学研究方法,探索出适宜的血清样本等电聚焦条件。2.证实在动脉粥样硬化发病过程中存在异常血清蛋白表达通过2D PDQuest的蛋白质点分析检测到每患者样品中有509±31蛋白质点,每健康对照样品中有565±29蛋白质点。通过对比分析研究冠状动脉粥样硬化患者及健康对照者的血清标本凝胶结果,发现冠状动脉粥样硬化患者和健康对照间存在33种差异表达蛋白质。将蛋白质点分别从二维凝胶中切取,进行胶内酶解,涂板后进行MALDI-TOF质谱分析。通过Mascot多肽指纹识别系统,按照蛋白质名称、NCBI编号、理论分子量和pI值,成功识别出27种差异表达蛋白质。在所识别的27种差异表达蛋白质中,与对照组相比,在动脉粥样硬化患者血清样本中有15种蛋白质表达升高,包括细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9,Cycin-dependent Kinase 9),而另外12种蛋白质则表达降低。3.所识别差异蛋白质的功能分类根据已经确定或推测的功能和细胞信号通路,将全部27种确定的蛋白质进一步划分为6个不同功能组别,包括细胞增殖和凋亡相关蛋白、炎症因子相关蛋白、免疫因子相关蛋白、能量代谢相关蛋白、信号通路相关分子和其它分子如血管紧张素Ⅱ受体等。在所发现的疾病高表达蛋白质分子中,CDK9明显高表达。参照近期报道的相关领域研究进展,CDK9与肿瘤、炎症和心肌肥大等疾病密切相关,本文选择了CDK9作为动脉粥样硬化的可能血清生物标记物作为下一步重点研究的目标分子。第二部分CDK9在冠状动脉粥样硬化疾病中的表达状况研究研究目的进一步探讨CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、单核细胞和冠状动脉粥样硬化斑块组织中的表达水平,为CDK9作为动脉粥样硬化血清标记物并以CDK9靶向诊断和治疗冠状动脉粥样硬化疾病提供依据。研究方法1.研究对象同第一部分。2. Western blot和ELISA检测血清CDK9表达水平分离冠状动脉粥样硬化患者和健康对照的空腹静脉血血清。样本稀释后做Western Blot检测血清CDK9蛋白表达水平；利用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清CDK9水平。3.外周血单个核细胞(PBMCs)中CDK9表达的检测1)分离PBMCs、淋巴细胞和单核细胞收集冠状动脉粥样硬化患者和健康对照的空腹静脉抗凝血,通过Ficoll-Hypaque梯度离心方法分离得到外周血单个核细胞(PBMCs),在PBMCs中加Hanks平衡盐液重新混悬细胞,进一步分离单核细胞和淋巴细胞。2) RT-PCR检测外周血单个核细胞中CDK9的mRNA表达分别提取PBMCs、淋巴细胞和单核细胞总RNA,利用人CDK9的特异引物进行RT-PCR,检测所测细胞内CDK9 mRNA表达状况。3) Western Blot检测外周血单个核细胞中CDK9的蛋白表达状况分别裂解提取PBMCs、淋巴细胞和单核细胞总蛋白,样本经10%SDS-PAGE后,利用抗CDK9抗体进行Western Blot,检测不同亚群细胞内CDK9蛋白表达状况。4.免疫组化染色及免疫荧光染色检测冠状动脉斑块组织中CDK9/CD14的表达首先选择兔动脉粥样硬化模型,取病变动脉血管组织,常规石蜡包埋,组织切片,进行苏木精／伊红(HE)染色和CDK9免疫组化染色。然后选择临床病理确诊的冠状动脉粥样硬化患者动脉斑块组织,常规石蜡包埋,组织切片,然后进行苏木精／伊红(HE)染色、CDK9免疫组化和免疫荧光染色,同时进行单核巨噬细胞表面标志CD14的免疫组化染色和免疫荧光染色,确定CDK9和CD14的亚细胞定位及二者表达的相关性。5.统计学分析：利用GraphPad Prism 5软件(San Diego, CA)处理有关数据。用one-way ANOVA、非配对或配对t检验分析。连续型变量资料用平均数±标准误表示,p0.05视为存在统计学差异。研究结果1.患者血清CDK9高表达Western Blot结果表明,在冠状动脉粥样硬化患者血清中CDK9表达明显升高,与健康对照者相比,p0.01；ELISA结果显示,患者血清中CDK9为149.70+105.22 U/L,而健康对照为64.51+25.94 U/L,二者相比有显著差异,p0.01。2.患者外周血单个核细胞及单核细胞中CDK9高表达与健康对照组相比,动脉粥样硬化患者组外周血单个核细胞,单核细胞和淋巴细胞中CDK9 mRNA及蛋白表达均明显升高。二者有显著差异,尤其是单核细胞中的表达显著高于健康对照组。两组中CDK9在外周血单核细胞亚群中的表达均高于其在淋巴细胞亚群的表达,p0.05。3.动脉粥样硬化斑块组织中CDK9明显高表达并与CD14表达正相关兔动脉粥样硬化组织HE染色结果证实,所选组织动脉粥样硬化斑块形成,斑块内有大量炎症细胞浸润,CDK9免疫组化染色结果表明斑块内有CDK9表达阳性细胞,阳性部位是细胞核。患者动脉粥样硬化斑块组织切片HE染色及CDK9和CD14免疫组化染色结果显示：与非斑块部分组织相比,斑块组织表现出不规则的内膜增厚、钙化和明显的动脉粥样硬化斑块形成,伴有明显的炎性细胞浸润。动脉粥样硬化斑块内膜部分CDK9阳性表达,阳性区主要位于细胞核内。此外,CD14(单核/巨噬细胞表面标志)在斑块部分阳性染色,提示斑块部分炎性细胞多数是浸润的单核细胞。而且免疫荧光染色结果显示CD14阳性染色细胞的CDK9表达水平增高,二者明显正相关,结果进一步提示CDK9在动脉粥样硬化病变浸润的单核细胞中具有重要作用。第三部分 CDK9对动脉粥样硬化炎症中单核细胞影响的初步研究研究目的研究炎症因子刺激下,抑制CDK9后对单核细胞CDK9表达、增殖、细胞周期、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响。研究方法1.THP-1细胞培养及处理人单核细胞急性白血病细胞系(THP-1)购于美国ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA),山东大学药学院张彩教授惠赠,本实验室常规传代培养,液氮中保存。将活化的人THP-1细胞置于含有10%胎牛血清(FBS),100μg/mL的链霉素,100u/mL的青霉素的完全RPMI1640培养液中,37℃5%CO2条件下培养。分别加入TNFa 50ng/mL,FLA 50nM或100nM,TNFa 50ng/mL+FLA 100nM及RPMI培养液对照,5%CO2,37℃培养6h或/和24h后进行不同实验。2. RT-PCR:同第二部分3. Western blot:同第二部分4.CCK-8方法检测细胞增殖：采用Cell Counting Kit-8,按说明书操作。5.细胞周期测定：采用Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit,按说明书操作。6.细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,按说明书操作。7.统计学分析：利用GraphPad Prism 5 (San Diego, CA)处理有关数据。连续型变量资料用平均数±标准误表示,用one-way ANOVA、非配对或配对t检验分析。p0.05认为有统计学差异。研究结果1.FLA可明显抑制TNFa-介导的THP-1表达同种型CDK943RT-PCR及Western Blot检测结果提示,未刺激的THP-1细胞亦有CDK9表达；加入FLA100 nM处理6h/24h后,THP-1细胞CDK9表达受到明显抑制；在TNFa刺激下,FLA的这种抑制作用更为显著,与对照组相比,具有统计学差异,p0.05。为探讨THP-1细胞CDK9两种同种型CDK955和CDK943表达影响是否存在差异,本文在培养的THP-1细胞中加入TNFa和／或FLA100nM处理6h,然后进行两种同种型的Western Blot分析,结果显示,在TNFa刺激下,FLA抑制CDK943的作用更加明显,而CDK955同种型表达量极少,且在TNFa和／或FLA作用下变化趋势不明显,提示TNFa刺激下的单核细胞的CDK943同种型表达发生变化,而CDK955同种型无明显变化。2.抑制CDK9可明显抑制TNFa介导的THP-1单核细胞增殖利用CDK9抑制剂FLA 100nM处理人单核细胞急性白血病细胞系THP-1细胞6h和24h,然后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖状况,结果显示,FLA单独处理或在TNFa存在下6h和24h,THP-1细胞的增殖均可受到明显抑制,高浓度FLA作用更加明显。3.抑制CDK9可明显导致TNFa介导的THP-1单核细胞G2/M期阻滞流式细胞分析结果表明100nMFLA处理THP-1细胞6h,可导致细胞G2/M期阻滞(G2/M期细胞百分比从10.9%升至12.6%),在TNFa刺激下,100nM FLA处理可以使G2/M期细胞百分比达到15.2%,而G0/G1或S期细胞百分比无显著变化。4.抑制CDK9可明显促进TNFa介导的THP-1单核细胞凋亡FLA 50和100nM处理THP-1细胞6h后,AnnexinV/PI细胞凋亡流式细胞分析结果显示,THP-1细胞早期凋亡和晚期凋亡均明显增加,p0.05。尤其是在TNFa刺激下,这种作用更加显著。5.抑制CDK9可明显促进TNFa介导的THP-1单核细胞促凋亡蛋白表达FLA 100nM处理THP-1细胞6h及24h后,Western Blot分析Bcl-2,Bax表达状况,结果表明FLA 100nM处理24h,Bax表达明显增加,而Bcl-2改变不明显；在TNFa刺激下这种作用更加显著。全文结论：本论文利用2DE-MALDI-TOF/MS蛋白组学技术,对比研究冠状动脉粥样硬化患者及健康对照者的血清蛋白差异表达,并进一步验证候选蛋白细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)与动脉粥样硬化疾病的相关性,取得以下创新性成果：1.成功识别冠状动脉粥样硬化患者血清存在的异常蛋白表达谱；与健康对照者血清相比,有27种差异表达蛋白。按照功能可将其分为6类,主要与炎症、免疫细胞和细胞信号通路等有关。2.在识别的血清差异表达蛋白中,深入研究证实了CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、外周血单个核细胞、单核细胞和动脉粥样硬化斑块组织中表达明显增高。冠状动脉粥样硬化斑块组织内CDK9高表达与高浸润性CD14+单核细胞/巨噬细胞明显正相关。3.初步证实CDK9抑制可以明显抑制TNFa刺激下的人单核细胞急性白血病系THP-1细胞的CDK943同种型的表达,抑制细胞增殖,导致TNFa刺激下的单核细胞的细胞周期G2/M期阻滞,促进细胞凋亡及促凋亡蛋白表达。本论文通过蛋白组学研究发现动脉粥样硬化疾病血清CDK9高表达,并验证该病患者血清,外周血细胞,动脉斑块组织中都存在CDK9高表达,提示CDK9在冠状动脉粥样硬化的致病过程中可能具有重要意义,有望成为潜在的冠状动脉粥样硬化新的血清标记物。本论文结果为研究冠状动脉粥样硬化血管疾病发病机理和靶向CDK9诊断治疗冠状动脉粥样硬化治疗提供了实验依据,具有重要理论和实际意义。论文创新点1.通过蛋白组学分析发现了冠状动脉粥样硬化患者和健康对照者血清蛋白的差异表达谱,获得27种差异蛋白并将其功能归类。2.研究证实CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、外周血单个核细胞,尤其是单核细胞中高表达。另外,还发现在动脉粥样硬化斑块组织中CDK9亦高表达,且与局部CD14高表达明显相关。结果表明：CDK9可能是冠状动脉粥样硬化重要的生物标记物。3.研究发现：通过抑制CDK9表达,可以抑制TNFa刺激下的人单核细胞系THP-1细胞CDK943同种型的表达,抑制细胞增殖,导致G2/M期阻滞,促进细胞凋亡及促凋亡蛋白的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

【参考文献】