NIX介导的线粒体自噬对ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡（pyroptosis）的影响

发布时间：2018-04-02 21:11

  本文选题：线粒体自噬　切入点：焦亡　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景及目的:细胞焦亡是一种依赖半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化的高炎症性细胞死亡形式,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)可诱导巨噬细胞发生caspase-1介导的细胞焦亡,在动脉粥样硬化进展期不稳定斑块形成中发挥重要作用。细胞自噬是细胞利用膜结构将需要降解的细胞器或蛋白等进行包裹形成自噬体,随后与溶酶体结合将其降解。缺乏自噬会导致活性氧簇ROS的产生及NLRP3炎症小体的活化,引起caspase-1介导的细胞焦亡。BNIP3基因家族是一个独特的Bcl-2家族BH3-only家族成员,包括BNIP3,NIX(也叫BNIP3L基因)。NIX定位于线粒体外膜,可与自噬相关蛋白(LC3和GABARAP等)结合,诱导线粒体自噬发生并降解清除多余的线粒体。NIX介导的线粒体自噬途径在哺乳细胞对损伤线粒体的降解中也发挥关键作用。我们前期研究表明ox-LDL作用于巨噬细胞后,对巨噬细胞自噬及细胞焦亡都产生影响。同时,随着ox-LDL的作用浓度增加,NIX的表达也随之增多。表明NIX对巨噬细胞线粒体自噬有一定的调控作用。但NIX介导的线粒体自噬对ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡的影响及机制目前尚不清楚。方法:1、ox-LDL作用于巨噬细胞J774A.1,通过RT-PCR检测NIX mRNA表达水平;western-blot检测NIX蛋白的表达情况,筛选合适的ox-LDL作用浓度和时间。2、采用western-blot检测ox-LDL作用后LC3-Ⅱ/Ⅰ及NIX的表达情况。线粒体自噬的检测用激光共聚焦观察LC3、NIX、线粒体共定位的情况;采用小干扰RNA沉默NIX表达观察对ox-LDL诱导线粒体自噬的影响;3、细胞焦亡的检测。采用LDH释放试剂盒检测LDH的释放,荧光显微镜观察细胞AO/EB的染色情况,western-blot检测caspase-1 p10、IL-1β的表达情况;以及沉默NIX表达后对ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡的影响;4、采用DCFH-DA染色流式细胞仪检测ox-LDL作用前后细胞内ROS的水平;采用western-blot检测NLRP3炎症小体的表达情况,以及沉默NIX表达后对ROS的水平和NLRP3活化的影响;结果:1、本研究显示ox-LDL处理巨噬细胞J774A.1后,NIX mRNA和蛋白的表达水平随着ox-LDL作用浓度的增高相应增加,并在100μg/ml增加幅度最大;在确定100μg/ml ox-LDL作用后随着时间的增加,检测NIX的表达情况也相应增加,其中6小时的增幅最高。2、ox-LDL作用于巨噬细胞J774A.1后,Western-blot结果表明LC3-П/Ⅰ的表达增多;激光共聚焦显微镜检测结果表明NIX、自噬体LC3、线粒体三者存在共定位关系;运用si RNA干扰技术靶向沉默NIX,抑制NIX的功能后,自噬通路中的自噬体LC3蛋白表达水平均较正常组减少。3、沉默NIX后,应用ox-LDL作用于巨噬细胞中,结果发现,LDH的释放和AO/EB染色阳性细胞所占百分比较正常组显著升高;caspase-1 p10和IL-1β蛋白的表达呈增高的趋势。4、沉默NIX后,应用ox-LDL作用于巨噬细胞中,ROS水平增加(90.5±0.48)%大于J774A.1组(69.3±0.75)%。NLRP3炎症小体的表达情况增多;结论:ox-LDL可诱导巨噬细胞发生caspase-1介导的细胞焦亡;NIX可能通过介导巨噬细胞线粒体自噬,从而降低细胞内ROS的水平及NLRP3炎症小体的活化,对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡发挥抑制作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

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本文编号：1702120